嵌合熒光染料是熒光定量PCR常用的DNA結(jié)合染料，能與雙鏈DNA非特異性結(jié)合，結(jié)合后發(fā)出熒光，可以通過檢測反應(yīng)體系中的染料熒光強(qiáng)度，達(dá)到檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。
通過PCR反應(yīng)生成雙鏈DNA，染料與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光，通過檢測熒光不但可以檢測反應(yīng)體系中的DNA擴(kuò)增量，同時還能測定擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA融解溫度。具體原理見下圖。
|
| |
 嵌合熒光染料法原理圖 |
| |
| ■ 雙標(biāo)記熒光探針法 |
雙標(biāo)記熒光探針法是使用5'端帶有熒光物質(zhì)（如：FAM等)，3'端帶有淬滅物質(zhì)（如:TAMRA等）的雙標(biāo)記熒光探針進(jìn)行熒光檢測的方法。當(dāng)探針完整時，5'端的熒光物質(zhì)受到3'端的淬滅物質(zhì)的制約，不能發(fā)出熒光。而當(dāng)雙標(biāo)記熒光探針被分解后，5'端的熒光物質(zhì)便會游離出來，發(fā)出熒光。
當(dāng)PCR反應(yīng)液中加入熒光探針后，在PCR反應(yīng)的退火過程中，熒光探針便會和模板雜交。進(jìn)一步在PCR反應(yīng)的延伸過程中，Taq DNA聚合酶的5'→3'Exonuclease活性可以分解與模板雜交的熒光探針，游離熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。通過檢測反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度，可以達(dá)到檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。具體原理見下圖。
|
| |
| |
 雙標(biāo)記熒光探針法原理圖 |
| |
| ■ CycleavePCR法原理 |
CycleavePCR法是由RNA和DNA構(gòu)成的雜合Cycling 探針與RNase H組合使用的高靈敏度檢測方法，能夠高效率地檢出目的基因。Cycling 探針內(nèi)部夾有RNA部分，一 端標(biāo)記熒光物質(zhì)，另一端標(biāo)記淬滅物質(zhì)，當(dāng)探針處于完整狀態(tài)時，由于熒光淬滅作用抑制熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，但當(dāng)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列雜交后，RNase H在RNA部分將探針切斷，淬滅抑制作用解除，熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，通過測定熒光強(qiáng)度，能夠?qū)崟r監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物量。
如果探針的RNA部分與模板不匹配，RNase H就不能在RNA部分將探針切斷，所以該檢出方法是一種即使一堿基不同也能識別的高特異性檢出方法，特別適合于SNP解析。
Cycling 探針堿基數(shù)少，一般為十二個堿基左右，熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離近, 淬滅效果好，熒光背景低，信噪比高。具體原理見下圖。
|
| |
 Cycling 探針法原理 |
| |
| ■ 利用CycleavePCR法的SNP解析原理 |
CycleavePCR法在SNP分型解析方面具有強(qiáng)大的優(yōu)勢。使用CycleavePCR法進(jìn)行SNP解析，在設(shè)計(jì)探針時，把多型位點(diǎn)或與其相鄰的第2 - 3個堿基設(shè)計(jì)成RNA，使用不同的熒光物質(zhì)分別標(biāo)記野生型和突變型探針，通過對兩種不同熒光物質(zhì)進(jìn)行雙通道同步檢測，實(shí)現(xiàn)對每個檢測樣品的SNP位點(diǎn)的基因型判定。
|
| |
 |
|
|
| |
京公網(wǎng)安備 110114000405號