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| PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit |
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| 1st-Strand cDNA合成反應(yīng) |
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| [標(biāo)準(zhǔn)操作流程] |
| 1. 在Microtube中配制下列反應(yīng)混合液。 |
| 試劑 |
使用量 |
Oligo dT Primer (50 μM)
or Random 6 mers (50 μM) |
1 μl
1 μl (0.4～2 μl)*1 |
| dNTP Mixture (10 mM each) |
1 μl |
| 模板RNA |
Total RNA：5 μg 以下
Poly(A)＋ RNA：1 μg 以下 |
| RNase free dH2O |
Up to 10 μl |
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| 2. 65℃保溫5 min后，冰上迅速冷卻。(注：上述處理可使模板RNA變性，提高反轉(zhuǎn)錄效率。) |
| 3. 在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，總量為20 μl。 |
| 試劑 |
使用量 |
上述變性后反應(yīng)液
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10 μl
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| 5×PrimeScript II Buffer |
4 μl |
| RNase Inhibitor (40 U/μl) |
0.5 μl (20 U)
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| PrimeScript II RTase (200 U/μl) |
1 μl (200 U) |
| RNase free dH2O |
Up to 20 μl |
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| 4. 緩慢混勻。 |
| 5. 按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)： |
| (30℃ 10 min) (使用Random 6 mers時(shí)) |
| 42℃ (～50℃ )*2 30～60 min |
| 6. 95℃ 5 min*3 (酶失活)后，冰上冷卻。 |
*1： 2 kb以下的cDNA合成時(shí)，Random 6 mers的使用量為1～2 μl；2 kb以上的cDNA合成時(shí)，Random 6 mers的使用量為0.4～1 μl。也可使用Gene Specific Primer，此時(shí)，其在反應(yīng)體系中的終濃度為0.1 μM。
*2： PrimeScript II RTase對(duì)具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板同樣具有良好的延伸性能，通?？稍?2℃下進(jìn)行反應(yīng)。使用特異性下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，有時(shí)會(huì)因錯(cuò)配而產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。此時(shí)可將反轉(zhuǎn)錄溫度升到45～50℃，可能會(huì)減少非特異性擴(kuò)增。
*3： 進(jìn)行長片段cDNA擴(kuò)增時(shí)，為了避免1st cDNA鏈的破損，請(qǐng)進(jìn)行70℃、15 min的失活反應(yīng)。 |
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