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| Premix Ex Taq™ (Probe qPCR) |
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| 應(yīng)用LightCycler/LightCycler 480 System的操作方法 |
| 請(qǐng)按照LightCycler/LightCycler 480（Roche Diagnostics公司）的使用說(shuō)明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作 |
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| 1. 按下列組份配制PCR反應(yīng)液（反應(yīng)液配制請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行）。 |
| 試劑 |
使用量 |
終濃度 |
| Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2X） |
10.0 μl |
1X |
| PCR Forward Primer（10 μM） |
0.4 μl |
0.2 μM*1 |
| PCR Reverse Primer（10 μM） |
0.4 μl |
0.2 μM*1 |
| Probe |
0.8 μl |
*2 |
| DNA模板 |
2.0 μl |
*3 |
| dH2O（滅菌水） |
6.4 μl |
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| Total |
20.0 μl |
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*1 通常引物終濃度為0.2 μM可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時(shí)，可以在0.1-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
*2 使用的探針濃度，與使用的Real Time PCR擴(kuò)增儀、探針?lè)N類、熒光標(biāo)記物質(zhì)種類有關(guān)，實(shí)際使用時(shí)請(qǐng)參照儀器說(shuō)明書，或各熒光探針的具體使用要求進(jìn)行。
*3 模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷貝數(shù)不同而不同，進(jìn)行梯度稀釋研討適當(dāng)?shù)哪０逄砑恿俊Ｄ０錎NA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反應(yīng)的cDNA (RT反應(yīng)液) 為模板時(shí)，添加量不要超過(guò)PCR反應(yīng)液總體積的10%。
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| 2. 進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。 |
| PCR反應(yīng)用毛細(xì)管請(qǐng)用離心機(jī)輕輕離心后放入LightCycler中進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。建議采用下列圖表顯示的兩步法PCR反應(yīng)程序，如果該程序得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，再進(jìn)行PCR條件的優(yōu)化。有關(guān)PCR的具體反應(yīng)條件請(qǐng)參照「PCR反應(yīng)條件概述」。 |
| ＜LightCycler＞ |
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| 兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序： |
| Stage 1：預(yù)變性 |
| 95℃ 30秒 20℃/秒 |
| 1 Cycle |
| Stage 2：PCR反應(yīng) |
| 95℃ 5秒 20℃/秒 |
| 60℃ 20秒 20℃/秒 |
| 40 Cycles |
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| ＜LightCycler 480 System＞ |
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| 兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序： |
| Denature |
| 95℃ 30秒 (Ramp rate: 4.4℃/sec) |
| 1 Cycle |
| PCR |
| Analysis Mode: Quantification |
| 95℃ 5秒 (Ramp rate: 4.4℃/sec) |
| 60℃ 30秒 (Ramp rate: 2.2℃/sec, Acquisition Mode : Single) |
| Cooling Cycle |
| Cooling |
| 50℃ 30秒 (Ramp rate: 2.2℃/sec) |
| 1 Cycle |
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◆特別提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗體的Hot Start用DNA聚合酶，與其他公司的化學(xué)修飾型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反應(yīng)前的95℃、5-15分鐘的酶的活性化反應(yīng)。如果高溫處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使酶的活性下降，其PCR的擴(kuò)增效率、定量準(zhǔn)確度等都會(huì)受到影響。如果在PCR反應(yīng)前進(jìn)行模板的預(yù)變性，通常設(shè)定為95℃、30秒。
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| 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。 |
| 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線，進(jìn)行PCR定量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線等。分析方法參見(jiàn)儀器的操作手冊(cè)。 |
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