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| Premix Ex Taq™ (Probe qPCR) |
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| 應(yīng)用Thermal Cycler Dice Real Time System III， II and Lite的操作方法 |
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| 1. 按下列組份配制PCR反應(yīng)液（反應(yīng)液配制請在冰上進行）。 |
| 試劑 |
使用量 |
終濃度 |
| Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2X） |
12.5 μl |
1X |
| PCR Forward Primer（10 μM） |
0.5 μl |
0.2 μM*1 |
| PCR Reverse Primer（10 μM） |
0.5 μl |
0.2 μM*1 |
| Probe |
1 μl |
*2 |
| 模板 |
2 μl |
*3 |
| dH2O（滅菌水） |
8.5 μl |
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| Total |
25 μl |
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*1 通常引物終濃度為0.2 μM可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時，可以在0.1-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
*2 使用的探針濃度，與使用的Real Time PCR擴增儀、探針種類、熒光標記物質(zhì)種類有關(guān)，試劑使用時請參照儀器說明書，或各熒光探針的具體使用要求進行。使用Thermal Cycler Dice Real Time System時，通常探針終濃度在0.1-0.5 μM范圍內(nèi)進行調(diào)整。
*3 模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷貝數(shù)不同而不同，進行梯度稀釋研討適當?shù)哪０逄砑恿俊Ｄ０錎NA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反應(yīng)的cDNA（RT反應(yīng)液）為模板時，添加量不要超過PCR反應(yīng)液總體積的10%。
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| 2. 進行Real Time PCR反應(yīng)。 |
| 建議采用下列圖表顯示的兩步法PCR反應(yīng)程序。退火/延伸時間可在20-30秒范圍內(nèi)進行調(diào)整，推薦使用30秒的條件。有關(guān)PCR的具體反應(yīng)條件請參照「PCR反應(yīng)條件概述」。 |
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兩步法PCR擴增標準程序： |
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| Stage 1：預(yù)變性 |
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| Cyclet：1 |
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| 95℃ 30秒 |
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| Stage 2：PCR反應(yīng) |
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| Cycle：40 |
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| 95℃ 5秒 |
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| 60℃ 30秒 |
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◆特別提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗體的Hot Start用DNA聚合酶，與其他公司的化學(xué)修飾型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反應(yīng)前的95℃、5-15分鐘的酶的活性化反應(yīng)。如果高溫處理時間過長，會使酶的活性下降，其PCR的擴增效率、定量準確度等都會受到影響。如果在PCR反應(yīng)前進行模板的預(yù)變性，通常設(shè)定為95℃、30秒。
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| 3. 實驗結(jié)果分析。 |
| 反應(yīng)結(jié)束后確認Real Time PCR的擴增曲線，進行PCR定量時制作標準曲線等。分析方法參見儀器的操作手冊。 |
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