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PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)
 
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：TB Green qPCR分析法
 
1. 去除基因組DNA反應(yīng)
按如下成分于冰上配制反應(yīng)混合液，為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，進行各項反應(yīng)時，應(yīng)先按反應(yīng)數(shù)+2的量配制Master Mix，然后再分裝到每個反應(yīng)管中，最后加入RNA樣品。
試劑 使用量
 5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μl  
 gDNA Eraser 1.0 μl  
 Total RNA *1  
 RNase Free dH2O up to 10 μl  
                         ↓
              42℃ 2 min（或者室溫5 min*2）
              4℃
 
2. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
反應(yīng)液配制請在冰上進行。為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，進行各項反應(yīng)時，應(yīng)先按反應(yīng)數(shù)+2的量配制Master Mix，然后再分裝10 μl到每個反應(yīng)管中*3。輕柔混勻后立即進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
試劑 使用量
 步驟1的反應(yīng)液 10.0 μl  
 PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μl  
 RT Primer Mix *4 1.0 μl  
 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4.0 μl  
 RNase Free dH2O 4.0 μl  
 Total 20 μl *5 
   
   
 
 Master Mix
 10 μl
 
   
                         ↓
                    37℃   15 min*6
                    85℃   5 sec
                    4℃*7
 
*1: 20 μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，TB Green qPCR法最多可使用1 μg的Total RNA，探針qPCR分析法最多可使用2 μg的Total RNA。
*2: 室溫反應(yīng)時，可以延長至30分鐘。
*3: 若不配制Master Mix，向步驟1的反應(yīng)液中添加試劑時，要先加入RNase Free dd2O和5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time)混合均勻，以使gDNA Eraser的活性充分受到抑制， 再添加RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix I，輕輕混勻進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
*4: 使用RT Primer Mix可以高效合成cDNA。因為實驗?zāi)康牟煌?，也可以不使用RT Primer Mix，而選擇Oligo dT Primer或Gene Specific Primer進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，引物使用量如下：
    Oligo dT Primer 50 pmol／20 μl反應(yīng)體系
    Gene Specific Primer 5 pmol／20 μl反應(yīng)體系
*5: 反轉(zhuǎn)錄體系可以根據(jù)需要相應(yīng)擴大。
*6: 使用Gene Specific Primer時，建議反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)置為42℃ 15 min。PCR反應(yīng)有非特異性擴增時，將溫度升到50℃會有所改善。
*7: 合成的cDNA需要長期保存時，請于-20℃或更低溫度保存。
注意:
1) 在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，TB Green qPCR法的RT Primer Mix 用量為1 μl，探針qPCR分析法的用量為4 μl。
2) 得到的RT反應(yīng)液加入到下一步的Real Time PCR反應(yīng)體系中，其加入量不要超過Real Time PCR反應(yīng)體積的1/10（V/V）量。