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| TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) |
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| 應(yīng)用Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System和StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法 |
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| 1. 按下列組份配制PCR反應(yīng)液（反應(yīng)液配制請在冰上進行）。考慮到吸取誤差，配置的預混液體積要至少多于所有反應(yīng)用總體積的10%。 |
| 試劑 |
使用量 |
使用量 |
終濃度 |
| TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2X） |
10 μl |
25 μl |
1X |
| PCR Forward Primer（10 μM） |
0.8 μl |
2 μl |
0.4 μM*1 |
| PCR Reverse Primer（10 μM） |
0.8 μl |
2 μl |
0.4 μM*1 |
ROX Reference Dye（50X）or
ROX Reference Dye II（50X）
*2 |
0.4 μl |
1 μl |
1X |
| DNA模板 *3 |
2 μl |
4 μl |
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| 滅菌水 |
6 μl |
16 μl |
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| Total |
20 μl*4 |
50 μl*4 |
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*1 通常引物終濃度為0.4 μM可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時，可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
*2 ROX Reference Dye II（50X）比ROX Reference Dye（50X）濃度低，使用ABI 7500 /7500 Fast Real-Time PCR System時，請使用ROX Reference Dye II（50X）。使用ABI 7300和StepOnePlus Real-Time PCR System時，請使用ROX Reference Dye（50X）。
*3 在20 μl反應(yīng)體系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時可進行梯度稀釋，確定合適的DNA模板添加量。另外，2 Step RT-PCR反應(yīng)的cDNA（RT反應(yīng)液）作為模板時的添加量不要超過PCR反應(yīng)液總體積的10%。
*4 按照各儀器推薦體系進行反應(yīng)液配制。 |
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| 2. 進行Real Time PCR反應(yīng)。 |
| 建議采用下列圖表顯示的兩步法PCR反應(yīng)程序，如果該程序得不到良好的實驗結(jié)果時，再進行PCR條件的優(yōu)化。由于使用Tm值較低的引物等原因，兩步法PCR反應(yīng)擴增性能較差時，可以嘗試進行三步法PCR擴增反應(yīng)。有關(guān)PCR的具體反應(yīng)條件請參照「實驗條件的選擇」。 |
| < Applied Biosystems 7300/7500和StepOnePlus Real-Time PCR System > |
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| 兩步法PCR擴增標準程序： |
| Stage 1：預變性 |
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Reps：1 |
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95℃ 30秒 |
| Stage 2：PCR反應(yīng) |
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Reps：40 |
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95℃ 5秒 |
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60℃ 30～34秒* |
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Dissociation stage |
* 使用StepOnePlus 時請設(shè)定在30秒。
使用7300時請設(shè)定在31秒。
使用7500時請設(shè)定在34秒。
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| < Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System > |
| 兩步法PCR擴增標準程序： |
| Stage 1： 預變性 |
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Number of Cycles：1 |
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95℃ 30秒 |
| Stage 2： PCR反應(yīng) |
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Number of Cycles：40 |
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95℃ 3秒 |
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60℃ 30秒 |
| Melt Curve Stage |
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◆特別提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗體的Hot Start用DNA聚合酶，與其他公司的化學修飾型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反應(yīng)前的95℃、5-15分鐘的酶的活性化反應(yīng)。如果高溫處理時間過長，會使酶的活性下降，其PCR的擴增效率、定量準確度等都會受到影響。如果在PCR反應(yīng)前進行模板的預變性，通常設(shè)定為95℃、30秒。
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| 3. 實驗結(jié)果分析。 |
| 反應(yīng)結(jié)束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR定量時制作標準曲線等。分析方法請參考儀器的操作手冊。 |
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