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| TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) |
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| 應用LightCycler/LightCycler 480 System Real Time PCR擴增儀的操作方法 |
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| 1. 按下列組份配制PCR反應液（反應液配制請在冰上進行）?？紤]到吸取誤差，配置的預混液體積要至少多于所有反應用總體積的10%。 |
| 試劑 |
使用量 |
終濃度 |
| TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2X） |
10 μl |
1X |
| PCR Forward Primer（10 μM） |
0.8 μl |
0.4 μM*1 |
| PCR Reverse Primer（10 μM） |
0.8 μl |
0.4 μM*1 |
| DNA模板（<100 ng）*2 |
2.0 μl |
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| 滅菌水 |
6.4 μl |
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| Total |
20.0 μl |
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*1 通常引物終濃度為0.4 μM可以得到較好結(jié)果。反應性能較差時，可以在0.1-.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
*2 在20 μl的反應體系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時可進行梯度稀釋，確定合適的DNA模板添加量。另外，2 Step RT-PCR反應的cDNA（RT反應液）作為模板時的添加量不要超過PCR反應液總體積的10%。 |
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| 2. 進行Real Time PCR反應。 |
| 建議采用下列圖表顯示的兩步法PCR反應程序，如果該程序得不到良好的實驗結(jié)果時，再進行PCR條件的優(yōu)化。由于使用Tm值較低的引物等原因，兩步法PCR反應擴增性能較差時，可以嘗試進行三步法PCR擴增反應。有關(guān)PCR的具體反應條件請參照「實驗條件的選擇」。 |
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| 兩步法PCR擴增標準程序： |
| Stage 1：預變性 |
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95℃ 30秒 20℃/秒 |
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1 Cycle |
| Stage 2：PCR反應 |
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95℃ 5秒 20℃/秒 |
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60℃ 20秒 20℃/秒 |
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40 Cycles |
Stage 3：融解曲線分析
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95℃ 0秒 20℃/秒 |
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65℃ 15秒 20℃/秒 |
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95℃ 0秒 0.1℃/秒 |
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| < LightCycler 480 System> |
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| 預變性 |
| 95℃ 30秒鐘（Ramp Rate4.4℃/秒） |
| 1 cycle |
| PCR |
| 分析模式：定量分析 |
| 95℃ 5 秒鐘 (Ramp Rate 4.4℃/秒) |
| 60℃ 30 秒鐘. (Ramp Rate 2.2℃/秒，Acquisition Mode : Single) |
| 40 cycles |
| 融解 |
| 分析模式：融解曲線 |
| 95℃ 5 秒鐘 (Ramp Rate 4.4℃/秒) |
| 60℃ 1 分鐘 (Ramp Rate 2.2℃/秒) |
| 95℃ (Ramp Rate 0.11℃/秒, Acquisition Mode : Continuous, Acquisitions : 5 per℃) |
| 1 cycle |
| 降溫 |
| 50℃ 30 秒鐘 (Ramp Rate 2.2℃/秒) |
| 1 cycle |
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◆特別提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗體的Hot Start用DNA聚合酶，與其他公司的化學修飾型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反應前的95℃、5-15分鐘的酶的活性化反應。如果高溫處理時間過長，會使酶的活性下降，其PCR的擴增效率、定量準確度等都會受到影響。如果在PCR反應前進行模板的預變性，通常設(shè)定為95℃、30秒。 |
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| 3. 實驗結(jié)果分析。 |
| 反應結(jié)束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR定量時制作標準曲線等。分析方法參見儀器操作手冊。 |
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