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TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)
 
實(shí)驗(yàn)條件的選擇
 
   如果按照推薦的兩步法條件進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)性能不好時(shí)，請(qǐng)按照下面的方法進(jìn)行引物和PCR反應(yīng)條件的研討。另外，根據(jù)反應(yīng)情況選擇特異性不同的Perfect Real Time系列試劑(Code No. RR420Q/A/B, RR430 S/A/B, RR091A/B)，可提高PCR反應(yīng)性能。
 
   實(shí)驗(yàn)條件選擇時(shí)，請(qǐng)從反應(yīng)特異性與擴(kuò)增效率兩方面進(jìn)行綜合考慮。要求能同時(shí)滿(mǎn)足這兩個(gè)條件的反應(yīng)體系，并可以在較大濃度范圍內(nèi)進(jìn)行很好的定量。
 
   ○ 反應(yīng)特異性高的實(shí)驗(yàn)體系應(yīng)具備以下條件：
      · No Template Control 時(shí)不產(chǎn)生引物二聚體等非特異性擴(kuò)增。
      · 不產(chǎn)生目的片段以外的擴(kuò)增。
 
   ○ 擴(kuò)增效率高的實(shí)驗(yàn)體系應(yīng)具備以下條件：
      · 擴(kuò)增產(chǎn)物起峰更早（Ct值?。?。
      · PCR擴(kuò)增效率高（接近理論值100％）。
 
1. Primer濃度與反應(yīng)性能間的關(guān)系如下：
   降低Primer濃度有助于提高特異性；提高Primer濃度有助于提高擴(kuò)增效率。圖示如下：
 
2. PCR條件與反應(yīng)性能間的關(guān)系如下：
   ① 要提高反應(yīng)特異性，可以提高退火溫度。
   ② 要提高擴(kuò)增效率，可以增加延伸時(shí)間或變?yōu)? Step PCR反應(yīng)。
   ③ 預(yù)變性。
      預(yù)變性條件通常設(shè)定為95℃ 30 sec，使用此條件對(duì)于難變性的環(huán)狀質(zhì)粒DNA和基因組DNA模板基本上也能夠很好的變性。如果對(duì)難變性的模板想改變變性條件，可以延長(zhǎng)至1～2分鐘。但是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)酶容易失活，不推薦使用2分鐘以上的變性條件。
 
3. 各種試劑與反應(yīng)性能間的關(guān)系如下：
   Takara Bio提供幾種不同的TB Green嵌合法real-time PCR試劑，這些試劑的反應(yīng)特異性以及擴(kuò)增效率間有以下關(guān)系。TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（Code No. RR420Q/A/B）和TB Green Fast qPCR Mix (Code No. RR430A/B)是擴(kuò)增效率與反應(yīng)特異性綜合性較好、通用性高的試劑，但是，如果想提高反應(yīng)特異性，使用TB Green Premix DimerEraser™ (Perfect Real Time)（Code No. RR091A/B）和TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820Q/A/B)則更有效。