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TB Green® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)
 
實驗條件的選擇
 
   如果按照推薦的兩步法條件進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)性能不好時，請按照下面的方法進(jìn)行引物和PCR反應(yīng)條件的研討。另外，根據(jù)反應(yīng)情況選擇特異性不同的TB Green Premix series (Code No. RR820A/B，RR091A/B)，可提高PCR反應(yīng)性能。
 
   實驗條件選擇時，請從反應(yīng)特異性與擴增效率兩方面進(jìn)行綜合考慮。要求能同時滿足這兩個條件的反應(yīng)體系，才可以在較大濃度范圍內(nèi)進(jìn)行很好的定量。
 
   ○ 反應(yīng)特異性高的實驗體系應(yīng)具備以下條件：
      · No Template Control 時不產(chǎn)生引物二聚體等非特異性擴增。
      · 不產(chǎn)生目的片段以外的擴增。
 
   ○ 擴增效率高的實驗體系應(yīng)具備以下條件：
      · 擴增產(chǎn)物起峰更早（Ct值?。?。
      · PCR擴增效率高（接近理論值100％）。
 
1. Primer濃度與反應(yīng)性能間的關(guān)系如下：
   降低Primer濃度有助于提高特異性；提高Primer濃度有助于提高擴增效率。圖示如下：
 
2. PCR條件與反應(yīng)性能間的關(guān)系如下：
   ① 要提高反應(yīng)特異性，可以提高退火溫度。
   ② 要提高擴增效率，可以增加延伸時間或變?yōu)? Step PCR反應(yīng)。
   ③ 預(yù)變性。
      預(yù)變性條件通常設(shè)定為95℃ 30 sec，使用此條件對于難變性的環(huán)狀質(zhì)粒DNA和基因組DNA模板基本上也能夠很好的變性。如果對難變性的模板想改變變性條件，可以延長至1～2分鐘。但是時間過長酶容易失活，不推薦使用2分鐘以上的變性條件。
 
3. 各種試劑與反應(yīng)性能間的關(guān)系如下：
   Takara Bio公司有三種TB Green嵌合法Real Time PCR試劑，這些試劑的反應(yīng)特異性以及擴增效率間有以下關(guān)系。TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (Code No.RR420A/B)是擴增效率高的試劑，但是，如果想提高反應(yīng)特異性，使用TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820A/B) 或TB Green Premix DimerEraser (Code No.RR091A/B) 則更有效。