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無標(biāo)題文檔
RNAiso Plus
雞軟骨及骨組織中的RNA提取
 
[使用試劑]
          RNAiso Plus（Code No. 9108）
          High-Salt Solution for Precipitation (Plant)（Code No. 9193）
 
[檢測(cè)樣品]
          雞軟骨組織 200 mg
          雞骨組織   200 mg
 
[方法]
          1. RNA提取
  · 將200mg雞軟骨組織和骨組織移至乳缽中，邊加液氮邊研磨至粉末。
  · 液氮揮發(fā)后，加入4ml RNAiso Plus，再次進(jìn)行勻漿后按照RNAiso Plus的操作流程進(jìn)行了RNA提取。但是在異丙醇沉淀時(shí)，加入0.25倍RNAiso Plus體積量的High-Salt Solution for Precipitation (Plant)混合，再加入0.25倍RNAiso Plus體積量的異丙醇，混合后再按照RNAiso Plus的操作流程回收了total RNA。最后溶解于30 μl RNase-free water。
  · 與沒有添加High-Salt Solution for Precipitation (Plant)的相同檢測(cè)樣品按照RNAiso Plus的操作流程回收的total RNA進(jìn)行了比較。
          2. RT-PCR
  · 使用1提取的RNA對(duì)β-actin進(jìn)行了RT-PCR。使用擴(kuò)增mRNA來源和基因組DNA來源DNA時(shí)擴(kuò)增片段大小不同的引物，對(duì)混入的基因組DNA進(jìn)行了確認(rèn)。
 
[結(jié)果]
          1. 提取RNA的電泳結(jié)果
             ＜軟骨組織＞
Lane： 提取方法
1、2：   RNAiso Plus
3、4：   RNAiso Plus＋High-Salt Solution for Precipitation (Plant)
 
             ＜骨組織＞
Lane： 提取方法
1、2：   RNAiso Plus
3、4：   RNAiso Plus＋High-Salt Solution for Precipitation (Plant)
Total RNA 5 μl Apply  
1% Agarose  
M： DL2,000 DNA Marker  
 
          2. 提取RNA的收量和純度
             ＜軟骨組織＞
檢測(cè)樣品No. 提取方法 提取量
（μl）		 A260 A280 A260/A230 A260/A280 RNA量*1
（μg/100 mg組織）
1 RNAiso Plus 30 66.36 44.60 1.06 1.49 79.63*2
2 RNAiso Plus 30 85.77 51.31 0.99 1.67 102.92*2
3 RNAiso Plus＋High-Salt 30 4.56 2.43 2.43 1.88 5.47
4 RNAiso Plus＋High-Salt 30 5.66 2.90 1.66 1.95 6.79
 
             ＜骨組織＞
檢測(cè)樣品 No. 提取方法 提取量
（μl）		 A260 A280 A260/A230 A260/A280 RNA量*1
（μg/100 mg組織）
1 RNAiso Plus 30 83.00 49.15 0.99 1.67 99.61*2
2 RNAiso Plus 30 80.46 57.75 0.91 1.39 96.55*2
3 RNAiso Plus＋High-Salt 30 4.56 2.55 1.75 1.97 6.01
4 RNAiso Plus＋High-Salt 30 5.66 3.28 2.08 1.98 7.79
 
              *1 RNA量：利用A260計(jì)算出的值
              *2 僅使用RNAiso Plus提取的檢測(cè)樣品中因含有大量的多糖等雜質(zhì)， 認(rèn)為A260的測(cè)定值沒有反映出準(zhǔn)確的RNA量。
 
          3. 提取的RNA進(jìn)行了RT-PCR反應(yīng)
 
RNA Sample： 各500 ng
RT Primer： Oligo dT Primer
反轉(zhuǎn)錄酶： Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)（Code No. 2641）
PCR酶： TaKaRa LA Taq（Code No.RR002A）
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)： 10 μl
PCR反應(yīng)體系： 50 μl（使用2 μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液）
Target： β-actin
mRNA來源的擴(kuò)增片段大?。?/span> 561bp
genome DNA來源的擴(kuò)增片段大?。?/span> 561bp
PCR 條件： 98℃  30 sec. 30 cycles
  55℃  10 sec.
  72℃  1 min.
 
             ＜骨組織＞
Lane： 提取方法
1：   RNAiso Plus
2：   RNAiso Plus                       [RTase（－）]
3：   RNAiso Plus＋High-Salt
4：   RNAiso Plus＋High-Salt            [RTase（－）]
PCR反應(yīng)液 10μl上樣  
3% Agarose  
M：100 bp DNA Ladder  
 
 
 
［總結(jié)］
  · 使用RNAiso Plus從骨和軟骨中提取RNA過程中，在異丙醇沉淀沈時(shí)加入High-Salt Solution for Precipitation (Plant)后回收RNA、可制備A260/A280比值高于1.8的高純度total RNA。軟骨來源RNA進(jìn)行凝膠電泳時(shí)還可確認(rèn)到核糖體RNA片段。
  · 從RT-PCR的結(jié)果可以看出，從軟骨中提取RNA時(shí)，僅使用RNAiso Plus 提取的RNA有微弱的擴(kuò)增產(chǎn)物，而使用High-Salt Solution for Precipitation (Plant)提取的RNA，軟骨來源和骨來源均可獲得清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，二者在RTase（－）的擴(kuò)增結(jié)果中沒有確認(rèn)到基因組來源的擴(kuò)增產(chǎn)物。
  · 一般從骨和軟骨組織中很難提取RNA，但使用RNAiso Plus提取RNA時(shí)與High-Salt Solution for Precipitation (Plant)并用可獲得如本實(shí)驗(yàn)所示的高純度RNA。