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PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase
標準PCR操作流程
 
   不僅介紹了延伸時間為1 min/kb的標準PCR反應操作流程，還介紹了DNA聚合酶的使用量為2倍、延伸時間為10 sec./kb的高速PCR反應的操作流程。
   PCR反應液的配制可在室溫下進行，但DNA聚合酶等各種試劑在配制前請于冰上放置。
 
1. PCR反應液的配制。
試劑 使用量 終濃度
 5× PrimeSTAR GXL Buffer 10 μl   1×  
 dNTP Mixture（2.5 mM each） 4 μl   200 μM each  
 Primer 1 10-15 pmol   0.2-0.3 μM*  
 Primer 2 10-15 pmol   0.2-0.3 μM*  
 Template 參考最適參數的設定(3)    
 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 μl   1.25 U/50 μl  
 滅菌蒸餾水 up to 50 μl    
   * 擴增10 kb以上的大片段DNA時，引物的終濃度為0.2 μM。
 
2. PCR反應條件。
   【擴增DNA片段≦10 kb時】
            98℃         10 sec. 30 Cycles [3-step PCR]
            55℃ or 60℃*1         15 sec.
            68℃*2         1 min./kb
              or
            98℃         10 sec. 30 Cycles [2-step PCR]
            68℃         1 min./kb
   *1 Tm值（按照下面的公式計算）為55℃以上時→退火溫度設定為60℃。
       Tm值為55℃以下時→退火溫度設定為55℃。
       ※ Tm值（℃）＝[ (nA＋nT) × 2 ]＋[ (nC＋nG) × 4 ]－5
       n表示引物中堿基個數
   *2 進行2 step PCR和3 step PCR反應時，均可以將Extension溫度設定為68℃。
   【擴增DNA片段為10 kb-30 kb時】
              98℃         10 sec. 30 Cycles
              68℃         10 min
   【擴增DNA片段為≧30 kb時】
              98℃         10 sec. 30 Cycles
              68℃         15 min
 
3. PCR反應條件的選擇。
   ① 擴增10 kb以下DNA片段時，請先嘗試3 step PCR。
   ② 對GC rich模板或擴增10 kb以上DNA片段時，推薦使用2 step PCR。
   ③ 無擴增產物或出現Smear、非特異性擴增產物時，請參考Troubleshooting進行調整。