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LA PCR時(shí)模板DNA的制備方法及使用量


超過10 kb以上的LA PCR擴(kuò)增反應(yīng)，不適合使用采取簡單方法（例如：只進(jìn)行細(xì)胞熱處理或蛋白酶處理）提取的DNA作為模板。建議使用經(jīng)過充分純化的完整DNA（沒有Nick等）作為模板。

以下為提取Human Genomic DNA和大腸桿菌Genomic DNA時(shí)的一般操作方法：
◆ Human Genomic DNA純化法
以HL60培養(yǎng)細(xì)胞（1.5×10⁹ Cells）為例。
1、將培養(yǎng)的HL60細(xì)胞（1.5×10⁹ Cells）收集后，用0.7%的NaCl溶液清洗兩次。
2、用15 ml的10 mM Tris-HCl（pH8.3）將細(xì)胞重懸。
3、在細(xì)胞重懸液中加入150 μl的Proteinase K（10 mg/ml）和150 μl的SDS（10%）進(jìn)行裂解。60℃溫育1小時(shí)后，再在37℃溫育16小時(shí)。
4、將15 ml的0.1 M Tris-HCl（pH8.0）飽和的苯酚加入上述溶液中，輕輕上下顛倒混合15分鐘。
5、9,000 rpm（約6,000×g）離心10分鐘。
6、將水相（上層）移至另一新的離心管中。再加入15 ml的0.1 M TE buffer（pH8.0）飽和的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），輕輕上下顛倒混合15分鐘。
7、室溫下9,000 rpm（約6,000×g）離心10分鐘。
8、將水相（上層）移至另一新的離心管中。再加入15 ml的氯仿/異戊醇（24：1），輕輕上下顛倒混合15分鐘。
9、室溫下9,000 rpm（約6,000×g）離心10分鐘。
10、將水相（上層）移至另一新的離心管中。加入1.5 ml的3 M醋酸鈉（pH5.2）和30 ml的99.5%乙醇，輕輕上下顛倒混合。
11、用細(xì)玻璃棒將DNA纏于玻璃棒上取出。
12、用80%乙醇沖洗纏有DNA的玻璃棒，干燥處理。
13、用10 ml的TE Buffer溶解DNA（將纏有DNA的玻璃棒放入TE Buffer中，4℃放置一夜）。然后加入100 μl的RNase A（10 mg/ml）， 37℃溫育1小時(shí)。
14、加入10 ml的0.1 M Tris-HCl（pH8.0）飽和的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），輕輕上下顛倒混合5分鐘。
15、9,000 rpm（約6,000×g）離心10分鐘。
16、將水相（上層）轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中。再加入10 ml的氯仿/異戊醇（24：1）。輕輕上下顛倒混合5分鐘。
17、9,000 rpm（約6,000×g）離心10分鐘。
18、將水相（上層）移至另一新的離心管中。加入1 ml的3 M醋酸鈉（pH5.2）和20 ml的乙醇，輕輕上下顛倒混合15分鐘。
19、用細(xì)玻璃棒將DNA纏于玻璃棒上取出。
20、用80%乙醇沖洗纏有DNA的玻璃棒，干燥處理。
21、用2 ml的TE Buffer溶解DNA（將纏有DNA的玻璃棒放入TE Buffer中，4℃放置一夜），然后調(diào)整DNA終濃度為0.5 mg/ml。

◆ 大腸桿菌Genomic DNA純化法
1、將200 ml L-Broth過夜培養(yǎng)（使用2 L燒瓶）的大腸桿菌2瓶離心收集菌體。用40 ml的Buffer（50 mM EDTA，50 mM Tris-HCl， pH8.0）重懸。
2、-80℃冷凍處理30分鐘。
3、將4 ml的0.25 M Tris-HCl（pH8.0）溶解的溶菌酶（10 mg/ml）加入到冷凍后的菌液中，室溫下融化并均勻混合，融化后的菌體于冰中放置45分鐘。
4、加入8 ml的STEP（0.5% SDS，50 mM Tris-HCl pH8.0，0.4 M EDTA，1 mg/ml Proteinase K）50℃溫育1小時(shí)。
5、加入45 ml的TE Buffer（10 mM Tris-HCl pH8.3，1 mM EDTA）。然后再加入96 ml的0.1 M Tris-HCl（pH8.0）飽和的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），上下顛倒輕輕混合5分鐘。
6、5,000 rpm（約4,000×g）離心15分鐘。
7、將水相（上層）移至另一新的離心管中。再加入96 ml的氯仿/異戊醇（24：1），輕輕上下顛倒混合5分鐘。
8、5,000 rpm（約4,000×g）離心15分鐘。
9、將水相（上層）移至另一新的離心管中。加入9 ml的3 M醋酸鈉（pH5.2）和225 ml的乙醇，輕輕上下顛倒混合。
10、用細(xì)玻璃棒將DNA纏于玻璃棒上取出。
11、用80%乙醇沖洗纏有DNA的玻璃棒，干燥處理。
12、用20 ml的TE Buffer溶解DNA（將纏有DNA的玻璃棒放入TE Buffer中，4℃放置一夜）。然后加入200 μl的RNase A（10 mg/ml）， 37℃保溫30分鐘。
13、加入20 ml的0.1 M Tris-HCl（pH8.0）飽和的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），輕輕上下顛倒混合5分鐘。
14、10,000 rpm（約7,500×g）離心15分鐘。
15、將水相（上層）轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，再加入20 ml的氯仿/異戊醇（24：1）。輕輕上下顛倒混合5分鐘。
16、10,000 rpm（約7,500×g）離心10分鐘。
17、將水相（上層）移至另一新的離心管中，加入2 ml的3 M醋酸鈉（pH5.2）和50 ml的乙醇，輕輕上下顛倒混合。
18、用細(xì)玻璃棒將DNA纏于玻璃棒上取出。
19、用80%乙醇沖洗纏有DNA的玻璃棒，干燥處理。
20、用20 ml的TE Buffer溶解DNA（將纏有DNA的玻璃棒放入TE Buffer中，4℃放置一夜），然后調(diào)整DNA終濃度為0.1 mg/ml。

■ 模板DNA的推薦使用量如下：
Human genome DNA：	0.1 μg～1 μg/50 μl PCR
E. coli Genome DNA：	10 ng～100 ng/50 μl PCR
λ DNA：	0.5 ng～2.5 ng/50 μl PCR

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