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Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)
 
應(yīng)用CFX96 Real-Time PCR Detection System的操作方法
 
請按照CFX96 Real-Time PCR Detection System（BIO-RAD）的使用說明書要求進行實驗操作。
1） 按下列組份配制PCR反應(yīng)液（反應(yīng)液配制請在冰上進行）。
試劑 使用量 終濃度
 Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2X） 12.5 μl   1X  
 PCR Forward Primer（10 μM） 0.5 μl   0.2 μM*1  
 PCR Reverse Primer（10 μM） 0.5 μl   0.2 μM*1  
 Probe 1 μl   *2  
 DNA模板 2 μl   *3  
 dH2O（滅菌水） 8.5 μl    
 Total 25 μl    
*1 通常引物終濃度為0.2 μM可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時，可以在0.1～1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
*2 使用的探針濃度，與使用的Real Time PCR擴增儀、探針種類、熒光標記物質(zhì)種類有關(guān)，實際使用時請參照儀器說明書，或各熒光探針的具體使用要求進行。
*3 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時可進行梯度稀釋，確定理想的DNA模板添加量。
    如果欲使用本制品進行2 Step RT-PCR反應(yīng)的第二步PCR擴增反應(yīng)，第一步的RT反應(yīng)液作為DNA模板時的添加量不要超過PCR反應(yīng)液總體積的10%。
 
2. 進行Real Time PCR反應(yīng)。
建議采用下列圖表顯示的兩步法PCR反應(yīng)程序，如果該程序得不到良好的實驗結(jié)果時，再進行PCR條件的優(yōu)化。有關(guān)PCR的具體反應(yīng)條件請參照
「PCR反應(yīng)條件概述」。
 
兩步法PCR擴增標準程序：  
反應(yīng)體系：25 μl  
Step 1: 95℃ 30秒  
Step 2: PCR  
GOTO: 39 (40 cycles)  
95℃ 5秒  
60℃ 30秒  
 
◆特別提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗體的Hot Start用DNA聚合酶，與其他公司的化學修飾型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反應(yīng)前的95℃、5-15分鐘的酶的活性化反應(yīng)。如果高溫處理時間過長，會使酶的活性下降，其PCR的擴增效率、定量準確度等都會受到影響。如果在PCR反應(yīng)前進行模板的預(yù)變性，通常設(shè)定為95℃、30秒。
 
3. 實驗結(jié)果分析。
反應(yīng)結(jié)束后確認Real Time PCR的擴增曲線，進行PCR定量時制作標準曲線等。分析方法參見儀器的操作手冊。