| PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase |
|
| |
| 高保真PCR酶PrimeSTAR系列保真性驗證 |
| |
| TaKaRa Bio 公司為了滿足廣大研究人員的需要提供各種PCR酶。其中PrimeSTAR®系列以其高保真性和高擴增效率作為「便于使用的高保真酶」受到廣大研究人員的好評。在本稿中介紹實際進行的重復序列擴增例及在長鏈目的基因的特異性位點進行的突變導入例，驗證PrimeSTAR®系列的保真性。 |
| |
| ■ 實驗例1：與各種PCR 酶的保真性比較（1） |
| ～ 富含GC 序列的目的基因～ |
| 本公司為了驗證PCR酶的保真性，選擇實際的方法對多個擴增產物測序后比較錯配率。擴增的目的基因序列設置在容易導入基因突變的富含GC 序列區(qū)域。 |
| 【方法】 |
| 以富含GC序列并容易發(fā)生堿基突變的Thermus thermophiles HB8基因組DNA為模板，任選10個區(qū)域（各擴增片段約為500 bp），使用各種PCR酶進行PCR擴增（反應液組份及PCR反應條件使用各酶推薦的操作流程）。將各自PCR擴增產物克隆至載體中，并對每種序列挑取復數的克隆進行測序確認堿基序列。以錯配堿基數對總解析堿基數的比率來測定mutant frequency（突變率）。 |
| 【結果】 |
| PrimeSTAR®系列各種PCR酶的擴增產物（約50萬個堿基）的測序結果表明，僅10～30個堿基發(fā)生了錯配?？梢钥闯銎浔Ｕ嫘詢?yōu)于高保真酶的起源酶Pfu DNA Polymerase（圖1）。 |
 |
| 圖1. PrimeSTAR® 系列與各種PCR 酶的保真性比較 |
| |
| |
| ■ 實驗例2：與各種PCR 酶的保真性比較（2） |
| ～ 重復序列～ |
| 本公司為了驗證PCR酶的保真性，選擇實際的方法對多個擴增產物測序后比較錯配率。擴增的目的基因序列設置在容易導入基因突變的富含GC 序列區(qū)域。 |
| 【方法1】 |
| 含-(GA)8-或-(CA)8-重復序列的500 bp DNA片段 （在λDNA來源的DNA序列中插入了重復序列）使用各種PCR酶，按照各酶的操作流程進行PCR擴增。將各自PCR擴增產物克隆至載體中，并對每種序列挑取復數的克隆進行測序確認堿基序列。以在重復序列中產生的堿基缺失及插入計算錯配率。 |
| 【方法2】 |
| 含-T26-重復序列的500 bp DNA片段（人基因組來源的DNA序列在質粒中克隆后的DNA片段）使用各種PCR酶進行PCR擴增、克隆、對復數的克隆測序后計數T堿基數。 |
| |
| 【結果】 |
重復序列的復制錯誤是因為PCR酶對模板的識別能力下降，校正活性（3' → 5'exonuclease 活性）不能修復。因此即使是具有校正活性的高保真α型DNA polymerase，與不具備校正活性的Taq DNA polymerase相比，其復制重復序列的保真性不一定更好。
從本次實驗結果可以看出，添加獨自研發(fā)的延伸因子的大幅提高了酶合成能力（processivity）的PrimeSTAR® Max 和PrimeSTAR® GXL，在擴增重復序列時具有優(yōu)良的保真性（表1、圖2）。 |
| |
| 表1. 各種PCR酶對重復序列［-(GA)8-、-(CA)8-的保真性 |
| -(GA)8- |
| |
全部克隆數 |
重復序列的堿基缺失和插入 |
突變克隆數
|
突變克隆數
的比例 |
| （GA）2組缺失
|
（GA）1組缺失 |
（GA）1組插入 |
| Taq |
261 |
3 |
21 |
2 |
26 |
10.00% |
| PrimeSTAR® HS |
250 |
5 |
25 |
2 |
32 |
12.80% |
| PrimeSTAR® Max |
201 |
0 |
5 |
0 |
5 |
2.49% |
| PrimeSTAR® GXL |
167 |
0 |
4 |
0 |
4 |
2.40% |
| A公司α型酶1 |
131 |
2 |
15 |
1 |
18 |
13.74% |
| A公司α型酶2 |
172 |
2 |
15 |
9 |
26 |
15.12% |
|
|
| |
| -(CA)8- |
| |
全部克隆數 |
重復序列的堿基缺失和插入 |
突變克隆數 |
突變克隆數
的比例 |
| （GA）2組缺失 |
（GA）1組缺失 |
（GA）1組插入 |
| Taq |
269 |
0 |
12 |
2 |
14 |
5.20% |
| PrimeSTAR® HS |
253 |
1 |
8 |
3 |
12 |
4.47% |
| PrimeSTAR® Max |
212 |
0 |
3 |
1 |
4 |
1.89% |
| PrimeSTAR® GXL |
167 |
0 |
3 |
0 |
3 |
1.80% |
| A公司α型酶1 |
131 |
0 |
8 |
1 |
9 |
6.87% |
| A公司α型酶2 |
179 |
1 |
7 |
10 |
18 |
10.06% |
|
|
| |
 |
| 圖2. 各種PCR酶對重復序列[-T26-]保真性 |
| |
| |
| |
京公網安備 110114000405號