| PrimeSTAR® Max DNA Polymerase |
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| 高保真PCR酶PrimeSTAR系列保真性驗(yàn)證 |
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| Takara為了滿足廣大研究人員的需要提供各種PCR酶。其中PrimeSTAR®系列以其高保真性和高擴(kuò)增效率作為「便于使用的高保真酶」受到廣大研究人員的好評(píng)。在本稿中介紹實(shí)際進(jìn)行的重復(fù)序列擴(kuò)增例及在長(zhǎng)鏈目的基因的特異性位點(diǎn)進(jìn)行的突變導(dǎo)入例，驗(yàn)證PrimeSTAR®系列的保真性。 |
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| ■ 實(shí)驗(yàn)例1：與各種PCR 酶的保真性比較（1） |
| ～ 富含GC 序列的目的基因～ |
| 本公司為了驗(yàn)證PCR酶的保真性，選擇實(shí)際的方法對(duì)多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后比較錯(cuò)配率。擴(kuò)增的目的基因序列設(shè)置在容易導(dǎo)入基因突變的富含GC 序列區(qū)域。 |
| 【方法】 |
| 以富含GC序列并容易發(fā)生堿基突變的Thermus thermophiles HB8基因組DNA為模板，任選10個(gè)區(qū)域（各擴(kuò)增片段約為500 bp），使用各種PCR酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增（反應(yīng)液組份及PCR反應(yīng)條件使用各酶推薦的操作流程）。將各自PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至載體中，并對(duì)每種序列挑取復(fù)數(shù)的克隆進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)堿基序列。以錯(cuò)配堿基數(shù)對(duì)總解析堿基數(shù)的比率來(lái)測(cè)定mutant frequency（突變率）。 |
| 【結(jié)果】 |
| PrimeSTAR®系列各種PCR酶的擴(kuò)增產(chǎn)物（約50萬(wàn)個(gè)堿基）的測(cè)序結(jié)果表明，僅10～30個(gè)堿基發(fā)生了錯(cuò)配?？梢钥闯銎浔Ｕ嫘詢?yōu)于高保真酶的起源酶Pfu DNA Polymerase（圖1）。 |
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| 圖1. PrimeSTAR® 系列與各種PCR 酶的保真性比較 |
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| ■ 實(shí)驗(yàn)例2：與各種PCR 酶的保真性比較（2） |
| ～ 重復(fù)序列～ |
| 本公司為了驗(yàn)證PCR酶的保真性，選擇實(shí)際的方法對(duì)多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后比較錯(cuò)配率。擴(kuò)增的目的基因序列設(shè)置在容易導(dǎo)入基因突變的富含GC 序列區(qū)域。 |
| 【方法1】 |
| 含-(GA)8-或-(CA)8-重復(fù)序列的500 bp DNA片段 （在λDNA來(lái)源的DNA序列中插入了重復(fù)序列）使用各種PCR酶，按照各酶的操作流程進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將各自PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至載體中，并對(duì)每種序列挑取復(fù)數(shù)的克隆進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)堿基序列。以在重復(fù)序列中產(chǎn)生的堿基缺失及插入計(jì)算錯(cuò)配率。 |
| 【方法2】 |
| 含-T26-重復(fù)序列的500 bp DNA片段（人基因組來(lái)源的DNA序列在質(zhì)粒中克隆后的DNA片段）使用各種PCR酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、對(duì)復(fù)數(shù)的克隆測(cè)序后計(jì)數(shù)T堿基數(shù)。 |
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| 【結(jié)果】 |
重復(fù)序列的復(fù)制錯(cuò)誤是因?yàn)镻CR酶對(duì)模板的識(shí)別能力下降，校正活性（3' → 5'exonuclease 活性）不能修復(fù)。因此即使是具有校正活性的高保真α型DNA polymerase，與不具備校正活性的Taq DNA polymerase相比，其復(fù)制重復(fù)序列的保真性不一定更好。
從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，添加獨(dú)自研發(fā)的延伸因子的大幅提高了酶合成能力（processivity）的PrimeSTAR® Max 和PrimeSTAR® GXL，在擴(kuò)增重復(fù)序列時(shí)具有優(yōu)良的保真性（表1、圖2）。 |
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| 表1. 各種PCR酶對(duì)重復(fù)序列［-(GA)8-、-(CA)8-的保真性 |
| -(GA)8- |
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全部克隆數(shù) |
重復(fù)序列的堿基缺失和插入 |
突變克隆數(shù)
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突變克隆數(shù)
的比例 |
| （GA）2組缺失
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（GA）1組缺失 |
（GA）1組插入 |
| Taq |
261 |
3 |
21 |
2 |
26 |
10.00% |
| PrimeSTAR® HS |
250 |
5 |
25 |
2 |
32 |
12.80% |
| PrimeSTAR® Max |
201 |
0 |
5 |
0 |
5 |
2.49% |
| PrimeSTAR® GXL |
167 |
0 |
4 |
0 |
4 |
2.40% |
| A公司α型酶1 |
131 |
2 |
15 |
1 |
18 |
13.74% |
| A公司α型酶2 |
172 |
2 |
15 |
9 |
26 |
15.12% |
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| -(CA)8- |
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全部克隆數(shù) |
重復(fù)序列的堿基缺失和插入 |
突變克隆數(shù) |
突變克隆數(shù)
的比例 |
| （GA）2組缺失 |
（GA）1組缺失 |
（GA）1組插入 |
| Taq |
269 |
0 |
12 |
2 |
14 |
5.20% |
| PrimeSTAR® HS |
253 |
1 |
8 |
3 |
12 |
4.47% |
| PrimeSTAR® Max |
212 |
0 |
3 |
1 |
4 |
1.89% |
| PrimeSTAR® GXL |
167 |
0 |
3 |
0 |
3 |
1.80% |
| A公司α型酶1 |
131 |
0 |
8 |
1 |
9 |
6.87% |
| A公司α型酶2 |
179 |
1 |
7 |
10 |
18 |
10.06% |
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| 圖2. 各種PCR酶對(duì)重復(fù)序列[-T26-]保真性 |
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