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使用T4 DNA Ligase連接質(zhì)粒載體和外源片段的實驗例
 
1. 配制以下反應(yīng)體系。
10×ligation buffer*1 2 μl
載體DNA 50 ng
插入DNA片段 (與載體DNA的摩爾比約為3)*2
T4 DNA Ligase (350 U/μl)  1 μl
滅菌水                                                            
Total 20 μl
 
 
2. 對于粘性末端連接，16℃反應(yīng)1-5小時；對于平末端連接，16℃反應(yīng)1-24小時。*3
 
3. 取連接液的一部分用于轉(zhuǎn)化*4。反應(yīng)液可以在-20℃保存。
 
*1 即T4 DNA Ligase (Code No.2011A/B)附帶buffer，buffer組成為(660 mM Tris-HCl (pH 7.6), 66 mM MgCl 2, 100 mM DTT, 1 mM ATP)
*2 載體與片段的最佳摩爾比根據(jù)DNA的大小、載體是否去磷酸化、DNA末端類型不同而變化，建議在1:1-1:10之間進行研討。
*3 如果連接存在困難，可以延長反應(yīng)時間。如果長時間進行反應(yīng)（大于16小時），可以在4℃進行反應(yīng)。
*4 如果需要進行電穿孔轉(zhuǎn)化等，請在下一步實驗前，對反應(yīng)液進行苯酚抽提、乙醇沉淀。