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T4 Polynucleotide Kinase
 
T4 Polynucleotide Kinase磷酸化反應(yīng)體系和條件
 
1. 使用PCR反應(yīng)液直接進(jìn)行DNA片段的5’末端磷酸化反應(yīng)
① 在微量離心管中配制下列反應(yīng)液，全量為20 μl。
 T4 Polynucleotide Kinase（10 U/μl） 2 μl  
 ATP（10 mM） 5 μl  
 10×Reaction Buffer 2 μl  
 PCR反應(yīng)液* ≤ 5 μl  
 dH2O up to 20 μl  
*PCR反應(yīng)液使用量應(yīng)為5 μl以下。
② 37℃反應(yīng)30分鐘。
③ 70℃加熱5～10分鐘使酶失活。
 
2. 使用純化后的雙鏈DNA片段的5’末端磷酸化反應(yīng)
① 在微量離心管中配制下列反應(yīng)液，全量為20 μl。
 T4 Polynucleotide Kinase（10 U/μl） 2 μl  
 ATP（10 mM） 5 μl  
 10×Reaction Buffer 2 μl  
 雙鏈DNA片段 ≤ 10 pmol  
 dH2O up to 20 μl  
② 37℃反應(yīng)30分鐘。
③ 70℃加熱5～10分鐘使酶失活。
 
3. 使用Primer、Linker、Adaptor、Probe的5’末端磷酸化反應(yīng)
① 在微量離心管中配制下列反應(yīng)液，全量為10 μl。
 T4 Polynucleotide Kinase（10 U/μl） 1 μl  
 ATP（10 mM） 1 μl  
 10×Reaction Buffer 1 μl  
 單鏈DNA片段 5～10 pmol  
 dH2O up to 10 μl  
② 37℃反應(yīng)30分鐘。
③ 70℃加熱5～10分鐘使酶失活。