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GC rich片段的擴增例

 
模板DNA為GC rich序列時,使用以往的Taq DNA Polymerase通常難以進行PCR擴增。TaKaRa LA TaqTaKaRa Ex Taq同以往的Taq DNA Polymerase相比,擴增效率高,可對一般難以擴增的DNA片段進行PCR擴增。
 
下面是GC含量為70%的DNA片段大小為3 kb的擴增例。
圖1對使用普通Taq DNA Polymerase和TaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2的PCR擴增進行了比較。結果顯示,普通Taq酶不能擴增的GC rich DNA片段,使用TaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2可進行良好的PCR擴增。
GC rich DNA片段進行PCR擴增時,以7-deaza-dGTP替代dGTP有時可獲得良好的擴增結果。如果想提高擴增效率,將dGTP和7-deaza-dGTP(或dTTP)混合后再使用可獲得更好的擴增結果(圖2)。
根據擴增片段的種類可優(yōu)化dGTP和7-deaza-dGTP(或dTTP)的混合比例,建議進行各種條件的研討決定最佳混合比例。
 
* Primer序列
M3-30 (將M3 Primer延長的DNA序列)
    5'-CAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'
RV-32 (將RV Primer延長的DNA序列)
    5'-GATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3'
Template:
VIII-5-pUC118
(大小為3 kb的GC rich DNA片段用Hind III酶切后插入到pUC118中)
擴增片段大小:
約3 kb
Primer*:
Custom long primer (30~32 mer)
(各10 pmol/50 μl PCR)
dNTP Mixture:
以7-deaza-dGTP替代dGTP
PCR條件:
94℃ 1 min
    ↓
  98℃ 20 sec.   30 cycles
  68℃ 5 min.  
(使用TaKaRa PCR Thermal Cycler 480)