GC rich片段的擴增例 | |||
模板DNA為GC rich序列時,使用以往的Taq DNA Polymerase通常難以進行PCR擴增。TaKaRa LA Taq和TaKaRa Ex Taq同以往的Taq DNA Polymerase相比,擴增效率高,可對一般難以擴增的DNA片段進行PCR擴增。 | |||
下面是GC含量為70%的DNA片段大小為3 kb的擴增例。 | |||
圖1對使用普通Taq DNA Polymerase和TaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2的PCR擴增進行了比較。結果顯示,普通Taq酶不能擴增的GC rich DNA片段,使用TaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2可進行良好的PCR擴增。 GC rich DNA片段進行PCR擴增時,以7-deaza-dGTP替代dGTP有時可獲得良好的擴增結果。如果想提高擴增效率,將dGTP和7-deaza-dGTP(或dTTP)混合后再使用可獲得更好的擴增結果(圖2)。 根據擴增片段的種類可優(yōu)化dGTP和7-deaza-dGTP(或dTTP)的混合比例,建議進行各種條件的研討決定最佳混合比例。 |
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* Primer序列 | |||
M3-30 (將M3 Primer延長的DNA序列) 5'-CAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' |
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RV-32 (將RV Primer延長的DNA序列) 5'-GATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3' |
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Template: |
VIII-5-pUC118 (大小為3 kb的GC rich DNA片段用Hind III酶切后插入到pUC118中) |
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擴增片段大小: |
約3 kb |
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Primer*: |
Custom long primer (30~32 mer) (各10 pmol/50 μl PCR) |
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dNTP Mixture: |
以7-deaza-dGTP替代dGTP |
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PCR條件: |
94℃ 1 min |
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↓ |
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98℃ 20 sec. | 30 cycles | ||
68℃ 5 min. | |||
(使用TaKaRa PCR Thermal Cycler 480) | |||