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Protocols
MightyAmp™ Genotyping Kit操作流程（Code No. R074A）
 
A．從組織材料中提取DNA（在室溫下操作）
1. 將組織材料*1放入已加入100 μl Extraction Buffer的PCR Tube中。
   【注意】Extraction Buffer出現(xiàn)沉淀時(shí)，加熱至60℃，緩慢攪拌溶解。
2. 將1 μl Proteinase K (20 mg/ml)加入到Tube中。
3. 60℃加熱5分鐘后，98℃再加熱2分鐘，然后降至室溫*2。
4. 室溫下離心，使組織材料沉淀，上清為PCR的模板（Extraction Buffer提取液）*3。
   *1：組織材料的添加標(biāo)準(zhǔn)
   · 小鼠尾≤2 mm
   · 小鼠耳≤5 mm2
   · 小鼠臟器≤30 mm3
   · 植物的葉≤5 mm2
   *2：4℃時(shí)會(huì)產(chǎn)生沉淀物，操作中請(qǐng)保持室溫(25℃)。
   *2：需要保存時(shí)，將上清移至新的Tube中于-20℃保存。
       使用前請(qǐng)將Extraction Buffer提取液溶解至室溫，確認(rèn)溶液中無(wú)沉淀物。
 
B．PCR反應(yīng)液配制（50 μl反應(yīng)量）
試劑 使用量 終濃度
  2×MightyAmp Buffer 25 μl 1×
  Primer 1 15 pmol 0.3 μM
  Primer 2 15 pmol 0.3 μM
  Extraction Buffer提取液* ≦ 2.5 μl  
  MightyAmp DNA Polymerase 1 μl 1.25 U/50 μl
  滅菌水 Up to 50 μl
 
* Extraction Buffer提取液必須達(dá)到室溫后再使用。建議Extraction Buffer提取液的添加量在反應(yīng)體系的1/20以下。其他試劑使用前請(qǐng)置于冰上。
 
C．PCR反應(yīng)條件設(shè)定
標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件為3 Step PCR，延伸溫度設(shè)定為68℃。
[3 Step PCR]  
                      98℃ 2 min*  
                       ↓
98℃ 10 sec.   30～40 cycles
60℃ 15 sec.  
68℃ 1 min/kb  
 
or  
[2 Step PCR]  
                      98℃ 2 min*  
                       ↓
98℃ 10 sec.   30～40 cycles
68℃ 1 min/kb  
 
 
* 使用了抗性非常強(qiáng)的Hot Start酶，在初期變性時(shí)必須進(jìn)行98℃ 2 min.的抗體變性步驟。
 
D．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳
· 電泳前將5 × Loading Dye和PCR產(chǎn)物按照1：4比例混合。
· 使用MightyAmp DNA Polymerase擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，電泳時(shí)請(qǐng)盡量使用TAE Buffer，使用TBE Buffer有時(shí)得不到好的電泳結(jié)果。