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Multiplex PCR基本反應(yīng)條件
 
Multiplex PCR Assay Kit Ver.2（Code No.RR062A/B）
 
【反應(yīng)組成】
 
2×Multiplex PCR Buffer（Mg2＋, dNTP plus） 25 μl
Primer mix *1 適量
Multiplex PCR Enzyme Mix 0.25 μl
DNA模板 適量
滅菌水 up to 50 μl
 
*1 通常各引物使用的終濃度為0.2 μM。不同的反應(yīng)，有時(shí)改變使用量會(huì)對(duì)結(jié)果有一定改善。
   引物的Tm值設(shè)定在55℃以上
   (Tm值按照下面的公式進(jìn)行計(jì)算）
   Tm值＝ 4 × (G、C數(shù)) ＋ 2 × (A、T 數(shù)) ＋ 35 － 2 × (總堿基數(shù))
   注) 利用Nearest Neighbor 法計(jì)算Tm值時(shí)，引物的Tm值設(shè)置在60℃以上。
 
【PCR條件】
【引物數(shù)在10對(duì)以下、擴(kuò)增片段為～2 kb 的反應(yīng)條件】
                                  94℃　60 sec.
                                    ↓
94℃　30 sec.   25～40 cycles
57～60℃　30～60 sec.  
72℃　30～60 sec.  
                                    ↓
                                  72℃　10 min.
 
【引物數(shù)超過(guò)10對(duì)時(shí)的反應(yīng)條件】
                                  94℃　60 sec.
                                    ↓
94℃　30 sec.   15～30 cycles
60℃　1～10 min. *1  
                                    ↓
                                  72℃　10 min.
 
*2 延伸時(shí)間根據(jù)引物數(shù)和反應(yīng)性能不同而不同。使用的引物數(shù)為200對(duì)時(shí)，以4 min為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)定。