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LA PCR時(shí)模板DNA的制備例
 
TaKaRa LA Taq（Code No. RR002A）
 
模板DNA的狀態(tài)是能否準(zhǔn)確進(jìn)行LA PCR的關(guān)鍵因素之一。
對超過10 kb的片段進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，使用簡單方法（比如細(xì)胞熱處理或只經(jīng)蛋白酶處理）制備的樣品DNA不適合作為模板。理想的是使用充分純化后的完整的DNA（不含nick等）。
 
（1）人基因組DNA的制備例
1. 從15個(gè)Petri培養(yǎng)皿中收集HL60細(xì)胞（1.5×109 cells），使用0.7％的NaCl溶液清洗2次。
2. 用15 ml 10 mM Tris-HCl（pH8.3）重懸細(xì)胞。
3. 在細(xì)胞懸液中加入150 μl的10 mg/ml 的Proteinase K和150 μl 10％ 的SDS，60℃孵育1小時(shí)后，再在37℃孵育16小時(shí)。
4. 將15 ml的0.1 M Tris-HCl（pH8.0）飽和的苯酚加入上述溶液中，輕輕混合15分鐘。
5. 9,000 rpm（約6,000×g）離心10分鐘。
6. 將上清（水相）轉(zhuǎn)移到另一個(gè)反應(yīng)管中，加入15ml TE Buffer（pH9.0）飽和的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），輕柔混勻15分鐘。
7. 9,000 rpm（約6,000×g）離心10分鐘。
8. 將上清（水相）轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)管中，加入15ml 氯仿/異戊醇（24:1），將反應(yīng)管上下顛倒輕柔混勻15分鐘。
9. 9,000 rpm（約6,000×g）離心10分鐘。
10. 將上清（水相）轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)管中，加入1.5 ml 3 M醋酸鈉（pH5.2）和30 ml乙醇，輕柔混勻。
11. 使用細(xì)玻璃棒將DNA纏于玻璃棒上。
12. 80％乙醇清洗，干燥。
13. 將DNA溶于10 ml的TE Buffer中（將纏有DNA的細(xì)玻璃棒置于TE buffer中，4℃放置一夜），加入100 μl 10 mg/ml的RNaseA，37℃孵育1小時(shí)。
14. 加入10 ml 苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），輕輕混勻5分鐘。
15. 9,000 rpm（約6,000×g）離心10分鐘。
16. 將上清（水相）轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)管中、加入10 ml氯仿/異戊醇（24：1），輕輕顛倒混合5分鐘。
17. 9,000 rpm（約6,000×g）離心5分鐘。
18. 將上清（水相）轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)管中，加入1 ml 3 M醋酸鈉（pH5.2）和20 ml乙醇，輕輕混勻。
19. 細(xì)玻璃棒纏繞回收DNA。
20. 80％乙醇清洗，干燥。
21. 用2 ml的TE Buffer溶解DNA（將纏有DNA的細(xì)玻璃棒置于Buffer中、4℃放置一晚）、調(diào)整其終濃度為0.5 mg/ml。
 
（2）大腸桿菌基因組DNA制備例
1. 將2瓶過夜培養(yǎng)的200 ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液離心收集菌體， 使用40 ml buffer（50 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH8.0）懸浮細(xì)胞。
2. －80℃冷凍30分鐘。
3. 加入4 ml 0.25 M Tris-HCl（pH8.0）溶解的終濃度為10 mg/ml的溶菌酶至冷凍菌液中，室溫下邊混勻邊溶融化。溶化后冰上靜置45分鐘。
4. 加入8 ml STEP〔0.5％ SDS、50 mM Tris-HCl（pH8.0）、0.4 M EDTA、1 mg/ml Proteinase K〕，50℃孵育1小時(shí)。
5. 加入45 ml TE Buffer〔10 mM Tris-HCl（pH8.3）、1 mM EDTA〕，然后再加入96 ml TE Buffer pH9.0飽和的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），上下顛倒輕輕混合5分鐘。
6. 5,000 rpm（約4,000×g）離心15分鐘。
7. 將上清（水相）轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入96 ml 氯仿/異戊醇（24：1），將反應(yīng)管上下顛倒輕輕混合5分鐘。
8. 5,000 rpm（約4,000×g）離心15分鐘。
9. 將上清（水相）轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入9 ml 3 M醋酸鈉（pH5.2）和225 ml乙醇、輕輕顛倒混合。
10. 將DNA纏于細(xì)玻璃棒上，回收。
11. 80％乙醇沖洗、晾干。
12. 將DNA溶解于20 ml的TE Buffer （將纏有DNA的玻璃棒置于4℃ Buffer中，放置一夜。）、加入10 μl 10 mg/ml 的RNaseA，37℃孵育30分鐘。
13. 加入20 ml上述苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），將反應(yīng)管上下輕輕顛倒混勻。
14. 10,000 rpm（約7,500×g）離心15分鐘。
15. 將上清（水相）轉(zhuǎn)到新的反應(yīng)管中，加入20ml 氯仿/異戊醇，將反應(yīng)管上下顛倒混勻5分鐘。
16. 10,000 rpm（約7,500×g）離心15分鐘。
17. 將上清（水相）轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)管中，加入2ml 3 M醋酸鈉（pH5.2）和50 ml的乙醇，輕輕上下顛倒混勻。
18. 用細(xì)玻璃棒將DNA纏繞回收。
19. 80％乙醇沖洗、晾干。
20. 用20 ml的TE Buffer溶解DNA （將纏有DNA的玻璃棒置于Buffer中4℃放置一夜），調(diào)整終濃度為0.1 mg/ml。
Takara銷售使用上述方法制備的DNA（用作Control Template）。（LA PCR? Genome DNA Set：Code No. 9060）
 
■ 推薦DNA使用量
人基因組DNA 0.1μg～1 μg/50 μl PCR
大腸桿菌基因組DNA 10 ng～100 ng/50 μl PCR
λ噬菌體DNA 0.5 ng～2.5 ng/50 μl PCR