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Control反應(yīng)的擴增
(TaKaRa LA PCR™ Kit Ver.2.1) |
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| Control反應(yīng) |
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| A. LA 篇 |
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| 本試劑盒作為control包含HT29來源的基因組DNA及擴增約17.5kb區(qū)域所需的引物。 |
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| 1. 按下述所示制備反應(yīng)液。
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反應(yīng)液量 |
終濃度 |
| 10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus） |
5 μl |
［1×］ |
| dNTP Mixture |
8 μl |
各400 μM |
| Control Primer LA3 |
1 μl |
0.2 μM |
| Control Primer LA4 |
1 μl |
0.2 μM |
| TaKaRa LA Taq |
0.5 μl |
2.5 U/50 μl |
| Control Template |
2 μl |
200 ng/50 μl |
| 滅菌水 |
32.5 μl |
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| Total |
50 μl |
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| 2. 為防止樣品蒸發(fā)、使用50 μl礦物油*或Ampli Wax PCR Gem**1個覆蓋反應(yīng)液。（使用TaKaRa PCR Thermal Cycler MP 或PERSONAL時不需要） |
* 反應(yīng)結(jié)束后如需完全去除礦物油，使用100 μl氯仿進行抽提。
** 如果使用Ampli Wax PCR Gem，不需要進行氯仿抽提。另外，Hot Start法可以自動化。 |
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3. 將反應(yīng)管置于Thermal Cycler中。
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| 4. 按以下條件進行PCR反應(yīng)。 |
| 98℃ |
20 sec.* |
30 cycles |
| 68℃ |
15 min. |
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| * 如果使用的是TaKaRa PCR Thermal Cycler MP，PERSONAL按照下述條件進行PCR反應(yīng)。 |
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| 不需要使用礦物油和PCR用Wax。 |
| 98℃ |
10 sec. |
30 cycles |
| 68℃ |
15 min. |
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| 5.反應(yīng)結(jié)束后、取部分反應(yīng)液（5～10 μl）進行凝膠電泳，確認反應(yīng)產(chǎn)物。使用Control Primer LA時，能確認得到約17.5 kb的條帶。 |
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| B. GC rich篇 |
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| 本試劑盒作為Control，包含HT29來源的基因組DNA以及擴增約1,255 bp區(qū)域（GC含量65％）所需的引物。 |
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| 1. 按下述所示制備反應(yīng)液。 |
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反應(yīng)液量 |
終濃度 |
| 2×GC Buffer I或2×GC Buffer II |
25 μl |
［1×］ |
| dNTP Mixture |
8 μl |
各400 μM |
| Control Primer GC1 |
1 μl |
0.2 μM |
| Control Primer GC2 |
1 μl |
0.2 μM |
| TaKaRa LA Taq |
0.5 μl |
2.5 U/50 μl |
| Control Template |
1 μl |
100 ng/50 μl |
| 滅菌水 |
13.5 μl |
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| Total |
50 μl |
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| 2. 同A.LA篇 |
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3. 同A.LA篇
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4. 按以下條件進行PCR反應(yīng)。
（Thermal Cycler TP2000、TP480、MP、PERSONAL等） |
| 94℃ |
1 min |
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| 94℃ |
30 sec. |
30 cycles |
| 60℃ |
30 sec. |
| 72℃ |
2 min. |
| 72℃ |
5 min. |
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| 5.反應(yīng)結(jié)束后、取部分反應(yīng)液（5～10 μl）進行凝膠電泳，確認反應(yīng)產(chǎn)物。使用Control Primer GC時，能夠確認得到1,255 bp的條帶。 |
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| 操作注意 |
| · 推薦DNA使用量 |
| 人基因組DNA |
0.1 μg～1 μg/50 μl PCR |
| 大腸桿菌基因組DNA |
10 ng～100 ng/50 μl PCR |
| λ噬菌體DNA |
0.5 ng～2.5 ng/50 μl PCR |
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·擴增長鏈DNA時的反應(yīng)液體積，建議為10～50 μl。反應(yīng)液體積大于50 μl時，可能會降低擴增效率。
·擴增長鏈DNA時用的引物，需設(shè)計為高特異性引物。為提高特異性，引物為30～35 mer時效果較好。
·模板DNA盡量使用純度較高的樣品。此外，擴增長鏈DNA時的模板DNA量，通常為一般PCR時的4～5倍量。
·試劑盒中的試劑恢復(fù)至室溫～37℃并完全溶解后，使用移液器或?qū)⒎磻?yīng)管上下顛倒使其充分混勻。請盡量避免vortex?；靹?0×LA PCR Buffer（以及2×GC Buffer）、TaKaRa LA Taq時，操作時請注意不要產(chǎn)生氣泡以避免引起酶失活。另外，試劑盒中各試劑至使用前于冰上保存。
·反應(yīng)開始前，輕輕吸打混勻反應(yīng)液。此時，注意一定不要使用vortex。
·如果樣品DNA有蛋白酶污染，先進行熱變性操作（denaturation step），之后加入TaKaRa LA Taq。通過熱失活蛋白酶能夠防止TaKaRa LA Taq的降解。 |
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