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標(biāo)準(zhǔn)操作流程
（TaKaRa PCR Amplification Kit）
 
[使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice時(shí)]
 
A. 對照反應(yīng)
本試劑盒包含λDNA和擴(kuò)增λDNA的6,012 bp及500 bp目的序列所需的引物。
 
1. 按下述所示制備反應(yīng)液。
  反應(yīng)液量 終濃度
 10 × LA PCR Buffer (Mg2+plus)* 5 μl  ［1×］
 dNTP Mixture 4 μl  各200 μM
 Control Primer1 0.5 μl  0.2 μM
 Control Primer2 or 3 0.5 μl  0.2 μM
 TaKaRa Taq 0.25 μl  1.25 U/50 μl
 Control Template 0.5 μl  0.5 ng/50 μl
 滅菌水 39.25 μl  
 Total 50 μl  
* 依需要可以使用10×PCR Buffer（Mg2+ free）和MgCl2溶液替代。
 
2. 將反應(yīng)管放入TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice中。
 
3. 按以下條件進(jìn)行設(shè)定。
 
使用Control Primer 1，2時(shí)（擴(kuò)增6,012 bp） 
 
94℃、1 min（denaturation）   30 cycles
68℃、4 min（annealing and extension）
72℃、5 min   1 cycle
 
使用Control Primer 1，3時(shí)（擴(kuò)增500 bp） 
 
94℃、30 sec（denaturation）   25 cycles
55℃、30 sec（annealing)
72℃、30 sec（extension)
72℃、2 min   1 cycle
 
按以上條件對Control Template的目的序列進(jìn)行擴(kuò)增。 
 
B. 樣品反應(yīng)
實(shí)驗(yàn)過程大致與對照反應(yīng)相同。
PCR反應(yīng)一般以變性、退火、延伸3個(gè)階段的溫度變化為基礎(chǔ)反應(yīng)，但是當(dāng)擴(kuò)增長片段時(shí)（≥6kb），將退火與延伸合并進(jìn)行2個(gè)階段溫度變化（shuttle PCR）的反應(yīng)更適合。
但是，需要按照目的序列大小、引物大小及堿基序列設(shè)定變性、退火、延伸各步驟中的適宜條件（溫度、時(shí)間）。
 
C. 電泳
反應(yīng)結(jié)束后的溶液取5～10 μl加入1/6量6×Loading Buffer，樣品加入到凝膠孔中，進(jìn)行電泳。凝膠的種類及濃度依DNA的大小、目的不同區(qū)分使用。
電泳后的凝膠浸入1μg/ml溴乙錠溶液中20～30分鐘，染色后紫外照射確認(rèn)DNA條帶。
 
操作注意事項(xiàng)
· 將試劑盒中的試劑混勻、離心后使用。注意， TaKaRa Taq需使用移液器輕柔混勻。此外，各試劑至使用前于冰上保存。
· 如果樣品DNA中混有蛋白酶污染，可在熱變性步驟之后加入TaKaRa Taq。將蛋白酶失活，防止TaKaRa Taq分解。
· 樣品DNA的制備方法不同，10×PCR Buffer（Mg2+ plus）中Mg2+的濃度可能不合適。此時(shí)，需要使用10×PCR Buffer（Mg2+ free）
   改變Mg2+濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)適宜的Mg2+濃度。