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PrimeScript™ RT-PCR Kit的實驗操作（Code No.RR014A）
 
A. Template RNA變性及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
A-1 配制下列反應(yīng)混合液
 
試劑 使用量
 dNTP Mixture（10 mM each） 1 μl
 Oligo dT Primer（2.5 μM）
 or Random 6 mers（20 μM）
 or Specific Primer（2 μM）*1 		1 μl
 Template RNA*2
 or Positive Control RNA 		[4×105 copies]
 RNase Free dH2O up to 10 μl
*1 合成cDNA的引物可結(jié)合實際情況從Oligo dT Primer、Random 6 mers、Specific Primer中任選一種（對于Control RNA，使用R-1 Primer）。
*2 Template RNA最多可加至8 μl，當(dāng)使用Total RNA時，最多可加至5 μg (推薦使用量：100 pg～1 μg)。
 
A-2 在PCR儀上進行變性、退火反應(yīng)
       65℃ 5 min
       4℃
NOTE：變性、退火操作有利于模板RNA的變性以及反轉(zhuǎn)錄引物和模板的特異性退火，可提高反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率。
 
A-3 在上述反應(yīng)管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
 
試劑 使用量
 上述變性、退火后反應(yīng)液 10 μl
 5×PrimeScript Buffer 4 μl
 RNase Inhibitor（40 U/μl） 0.5 μl
 PrimeScript RTase（for 2 Step） 0.5 μl
 RNase Free dH2O 5 μl
 Total Volume 20 μl
 
A-4 在PCR儀上按下列條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
       （30℃              10 min.）*3
       42℃（～50℃）     15～30 min.
       95℃                5 min.*4
       4℃
 
*3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物為Random 6 mers時，此操作可使Random 6 mers在42℃ (～50℃) 和模板RNA充分退火、延伸，增加反轉(zhuǎn)錄效率。
*4 進行長片段DNA擴增時，為了保證1st strand cDNA完整，請進行70℃、15 min 的失活反應(yīng)。。
 
NOTE：PrimeScript RTase對具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的模板同樣具有良好的延伸性能，通?？稍?2℃下進行反應(yīng)。使用特異性下游引物進行反轉(zhuǎn)錄時，有時會因錯配而產(chǎn)生非特異性擴增。此時可將溫度升到50℃，可能會減少非特異性擴增。
 
B. PCR反應(yīng)
B-1 按下列組成配制PCR反應(yīng)液
 
試劑 使用量 Final concentration
 10×PCR Buffer Ⅱ 5 μl 1×  
 dNTP Mixture（10 mM each） 2 μl 400 μM
 Upstream Primer（20 μM）*5（Sense） 0.5 μl 0.2 μM
 Downstream Primer（20 μM）*6（Anti-sense） 0.5 μl 0.2 μM
 TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μl） 0.5 μl  
 上述的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 ≤5 μl  
 滅菌水 up to 50 μl  
*5 Positive Control RNA使用F-1 Primer。
*6 Positive Control RNA使用R-1 Primer。
 
B-2 按照下面的反應(yīng)條件進行反應(yīng)
 
一般反應(yīng)條件
（A）三步法PCR的反應(yīng)條件： 30 cycles （B）兩步法PCR的反應(yīng)條件： 30 cycles
94℃ 30 sec.   98℃ 10 sec.  
55～65℃ 30 sec.   68℃ 1 min./kb  
72℃ 1 min./kb    
 
Positive Control RNA*7的反應(yīng)條件
94℃ 30 sec.   30 cycles
60℃ 30 sec.  
72℃ 1 min  
 
*7 在進行PCR擴增時使用Control Primer F-1和R-1引物，都可以得到462 bp的PCR擴增產(chǎn)物。