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2 Step RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程
PrimeScript™ II High Fidelity RT-PCR Kit（Code No.R023A）
 
A. 模板RNA的變性及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
 
1. 在Microtube管中配制下列混合液。
 
試劑 使用量
 dNTP Mixture（10 mM each） 1 μl
 Oligo dT Primer（50 μM）
 or Random 6 mers（20 μM）
 or Specific Primer（2 μM）*1 		1 μl
 Template RNA*2
 (Positive Control RNA [4×105 copies]) 		2 μl
 RNase Free dH2O up to 10 μl
*1 合成cDNA的引物可結(jié)合實(shí)際情況從Oligo dT Primer、Random 6 mers、Specific Primer中任選一種，請(qǐng)參照說(shuō)明書(shū)中【2 Step RT-PCR時(shí)引物的選擇】。
*2 Template RNA最多可加至8 μl，當(dāng)使用Total RNA時(shí)，最多可加至6 μg（推薦使用量：100 ng～2 μg）。
 
2. 在PCR儀上進(jìn)行變性、退火反應(yīng)。
              50℃ 30 min.
              4℃
<重要> 該操作使模板RNA變性，提高反轉(zhuǎn)錄效率。
 
3. 在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。
 
試劑 使用量
 上述變性、退火后反應(yīng)液 10 μl
 5×PrimeScript II Buffer 4 μl
 PrimeScript II RT Enzyme Mix 1 μl
 RNase Free dH2O 5 μl
  20 μl
 
4. 在PCR儀上按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
              (30℃              10 min)*3
              42℃（～50℃） 15～30 min
              95℃              5 min*4
              4℃
<重要> 因PrimeScript II RTase對(duì)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的模板同樣具有良好的延伸性能，通?？稍?2℃下進(jìn)行反應(yīng)。使用特異性下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，有時(shí)會(huì)因引物錯(cuò)配而產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。此時(shí)將溫度在45℃~50℃范圍內(nèi)調(diào)整，可能會(huì)減少非特異性擴(kuò)增。
 
*3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物為Random 6 mers時(shí)，進(jìn)行此操作可使Random 6 mers在42℃（～50℃）和模板RNA充分退火、延伸，增加反轉(zhuǎn)錄效率。
*4 進(jìn)行長(zhǎng)片段DNA擴(kuò)增時(shí)，為了避免破損1st cDNA鏈，請(qǐng)進(jìn)行70℃、15 min的失活反應(yīng)。
 
B. PCR反應(yīng)
 
1. 按下列組成配制PCR反應(yīng)液。
 
試劑 使用量 終濃度
 5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μl 1×
 dNTP Mixture（10 mM each） 1 μl 200 μM
 上游Primer（20 μM）*5 0.5 μl 0.2 μM
 下游Primer（20 μM）*6 0.5 μl 0.2 μM
 PrimeSTAR® GXL for RT-PCR 2 μl  
 上述的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 ≤5 μl  
 滅菌水 up to 50 μl  
 
*5 Positive Control RNA使用F-1 Primer。
*6 Positive Control RNA使用R-1 Primer。
 
2. 反應(yīng)條件
【一般實(shí)驗(yàn)的PCR反應(yīng)條件】
98℃ 10 sec.   30 cycles 98℃ 10 sec.   30 cycles
55 or 60℃*7 15 sec.   68℃ 1 min./kb  
68℃ 1 min./kb        
 
【Positive Control RNA的PCR反應(yīng)條件】*8
98℃ 10 sec.   30 cycles      
60℃ 15 sec.    
68℃ 1 min.        
 
*7 退火溫度
引物的Tm值（按下述公式計(jì)算）在55℃以上時(shí)，設(shè)定為60℃；引物的Tm值在55℃以下時(shí)，設(shè)定為55℃。
Tm 值計(jì)算方法
Tm 值（℃）＝[（A、T數(shù)）× 2 ]＋[（G、C數(shù)）× 4 ]－5
*8 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用Oligo dT Primer、Random 6 mers、R-1 Primer中的任何一種引物，PCR反應(yīng)使用Control F-1 Primer/Control R-1 Primer時(shí)擴(kuò)增片段大小均為462 bp。
 
【有關(guān)PCR反應(yīng)條件的說(shuō)明】
■ 擴(kuò)增片段＜8 kb時(shí)，請(qǐng)先嘗試使用3 Step PCR。
■ 使用GC rich模板及擴(kuò)增片段＞8 kb時(shí)，推薦使用2 Step PCR法。
 
上述反應(yīng)條件下擴(kuò)增效率不良時(shí)，請(qǐng)進(jìn)行如下研討：
 
＜擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)Smear及非特異性擴(kuò)增時(shí)＞
① 將退火溫度每次間隔2℃上升至63℃。
② 使用2 Step PCR。
③ 引物的Tm值在50℃以下時(shí)，退火溫度嘗試在50～55℃之間選擇。
 
＜無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物少時(shí)＞
① 嘗試每次間隔2℃降低退火溫度。
② 合適的引物終濃度在0.3～0.5 μM之間選擇。
使用PrimeSTAR GXL進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)時(shí)，不能用dUTP替代dTTP（反應(yīng)效果明顯下降）。此外，請(qǐng)盡量避免使用含有次黃嘌呤（I）的引物。