欧美成 人版在线_久久免视看国产_亚洲成l人在线观看线路_久久96热在精品国产网站

1 Step RT-PCR標準操作流程
PrimeScript™ II High Fidelity RT-PCR Kit（Code No.R023A）
 
1. 按下列組成配制PCR反應液。
 
試劑 使用量 終濃度
 5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μl 1×
 dNTP Mixture（10 mM each） 1 μl 200 μM
 PrimeScript II RT Enzyme Mix 1 μl  
 PrimeSTAR GXL for RT-PCR 2 μl  
 上游Primer（20 μM）*1 1 μl 0.4 μM
 下游Primer（20 μM）*2 1 μl 0.4 μM
 Template RNA*3 *3  
 RNase Free dH2O up to 50 μl  
 
*1 Positive Control RNA使用F-1 Primer。
*2 Positive Control RNA使用R-1 Primer。
*3 建議Total RNA的使用量范圍在10~1,000 ng之間，Positive Control RNA為模板時使用量為1 μl。
 
2. 反應條件
【一般實驗的PCR反應條件】
 
              45℃*4 30 min.
              94℃ 2 min
                   ↓
98℃ 10 sec.   30 cycles or 98℃ 10 sec.   30 cycles
60 or 55℃*5 15 sec.   68℃ 1 min./kb  
68℃ 1 min./kb        
 
【Positive Control RNA的PCR反應條件】 Control反應可確認到462 bp的擴增片段。
              45℃ 30 min.
              94℃ 2 min
                   ↓
98℃ 10 sec.   30 cycles      
60℃ 15 sec.    
68℃ 1 min.        
 
*4 反轉(zhuǎn)錄反應溫度
使用PrimeScript II RTase（PrimeScript II RT Enzyme Mix中含有）可以提高反應特異性，使用特異性下游引物進行反轉(zhuǎn)錄反應時，可在45℃進行反轉(zhuǎn)錄反應，不會引起RNA的降解及酶的失活。
*5 退火溫度
引物的Tm值（按下述公式計算）在55℃以上時，設定為60℃；引物的Tm值在55℃以下時，設定為55℃。
Tm 值計算方法
Tm 值（℃）＝[（A、T數(shù)）× 2 ]＋[（G、C數(shù)）× 4 ]－5
 
【PCR反應條件的選擇】
■ 請先嘗試使用3 Step PCR。
■ 使用GC rich模板時推薦使用2 Step PCR法。
 
上述反應條件下擴增效率不良時，請進行如下研討：
 
＜擴增產(chǎn)物出現(xiàn)Smear及非特異性擴增時＞
① 將退火溫度每次間隔2℃上升至63℃。
② 使用2 Step PCR。
③ 引物的Tm值在50℃以下時，退火溫度嘗試在50～55℃之間選擇。
 
＜無擴增產(chǎn)物或擴增產(chǎn)物少時＞
① 模板使用量根據(jù)推薦量來添加。
② 增加PCR循環(huán)圈數(shù)至40~50 Cycles。
③ 嘗試每次間隔2℃下降退火溫度。
 
* 使用PrimeSTAR GXL進行RT-PCR反應時不能用dUTP替代dTTP（反應效果明顯下降）。此外，請盡量避免使用含有次黃嘌呤的引物。