| PrimeScript™High Fidelity RT-PCR Kit的操作方法 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| A. 模板RNA的變性及反轉錄反應 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| A-1. 按下述所示制備反應液 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 試劑 | 使用量 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| dNTP Mixture（10 mM each） | 1 μl | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Oligo dT Primer (2.5 μM) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| or Random 6 mers(20 μM) |  |
1 μl | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| or Specific Primer (2 μM)*1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Template RNA*2 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| or Positive Control RNA | ［4×105 copies］ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| RNase Free dH2O | up to 10 μl | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| *1 合成cDNA的引物可結合實際情況從Oligo dT Primer、Random 6 mers、Specific Primer中任選一種。 *2 Template RNA最多可加至8 μl，當使用Total RNA時，最多可加至3 μg（推薦使用量：100 ng～1 μg）。 |
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| A-2. 制備后的反應管置于Thermal Cycler中，按下述程序進行變性，退火。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 65℃ 5 min. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 4℃ | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ＜重要＞通過上述變性?退火操作，反轉錄引物能夠特異性的與模板RNA退火，提高反轉錄效率。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| A-3. 變性·退火后的反應液添加以下試劑。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 試劑 | 使用量 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| A-2 的變性·退火后的反應液 | 10 μl | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5×PrimeScript Buffer | 4 μl | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| RNase Inhibitor (40 U/μl) | 0.5 μl | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PrimeScript RTase | 0.5 μl | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| RNase Free dH2O | 5 μl | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 20 μl | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| A-4. 反應管置于Thermal Cycler中，按照下述程序進行反轉錄反應。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| (30℃ 10 min.)*3 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 42℃ （～ 50）℃ 15～30 min. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 95℃ 5 min.*4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 4℃ | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| *3 反轉錄反應使用Random 6 mers時，進行此操作可使Random 6 mers與模板RNA在42℃（～50℃）充分退火延伸，從而提高反轉錄效率。 *4 進行長片段DNA 擴增時，為了避免破損1st cDNA 鏈，可70℃反應15 min進行失活操作。 |
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| ＜重要＞ 對于高級結構，PrimeScript RTase具有很強的延伸性能，通常反應在42℃進行。使用特異性的下游PCR引物進行反轉錄時，會出現(xiàn)由于引物錯配導致的非特異性擴增產物。此時，可以通過將反應溫度設置為50℃進行改善。 |
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| B. PCR反應 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| B-1. 按下述所示制備反應液 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 試劑 | 使用量 | 終濃度 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PrimeSTAR Max Premix（2×） | 25 μl | 1× | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 上游Primer（20 μM）*5（sense） | 0.5 μl | 0.2 μM | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 下游Primer（20 μM）*6（antisense） | 0.5 μl | 0.2 μM | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| A-4 中的反轉錄反應液 | ≤5 μl | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 滅菌水 | up to 50 μl | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| *5 Positive Control RNA時，使用F-1 Primer *6 Positive Control RNA時，使用R-1 Primer |
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| B-2. 制備后的反應管放于Thermal Cycler中，以適宜條件進行PCR。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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