| 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中引物的選擇、RNA樣品的制備、操作注意事項(xiàng) | ||||||||
| 1. 關(guān)于反轉(zhuǎn)錄引物的選擇 | ||||||||
| 用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)具體情況選擇Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer或特異性下游引物。對(duì)于不具有Hairpin構(gòu)造的短鏈mRNA，3種引物中的任何一種都可以使用，但一般應(yīng)按以下方法進(jìn)行選擇。 | ||||||||
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| 2. RNA樣品制備 | ||||||||
| 本試劑盒是把RNA合成cDNA，然后再對(duì)此cDNA進(jìn)行擴(kuò)增的試劑盒。RNA的純度會(huì)影響cDNA的合成量，而制備RNA的關(guān)鍵是要抑制細(xì)胞中的RNA分解酶和防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。因此，在實(shí)驗(yàn)中必須采取以下措施：戴一次性干凈手套；使用RNA操作專用實(shí)驗(yàn)臺(tái)；在操作過程中避免講話等等。通過以上辦法可以防止實(shí)驗(yàn)者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。 | ||||||||
| 【使用器具】 | ||||||||
| 盡量使用一次性塑料器具。若使用玻璃器具，應(yīng)在使用前按下列方法進(jìn)行處理。 | ||||||||
| （1） 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下處理12小時(shí)。 （2） 然后在120℃下高壓滅菌30分鐘以除去殘留的DEPC。 |
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| RNA實(shí)驗(yàn)用的器具和儀器建議專門使用，不要用于其它實(shí)驗(yàn)。 | ||||||||
| 【試劑配制】 | ||||||||
| 用于RNA實(shí)驗(yàn)的試劑，包括蒸餾水，須使用干熱滅菌（180℃，60 min.）或用上述方法進(jìn)行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可使用RNA實(shí)驗(yàn)用的一次性塑料容器），使用的滅菌水須用0.1%的DEPC處理后進(jìn)行高溫高壓滅菌。 | ||||||||
| RNA實(shí)驗(yàn)用的試劑和滅菌水都應(yīng)專用，避免混用后交叉污染。 | ||||||||
| 【制備方法】 | ||||||||
| 使用簡(jiǎn)單的RNA純化方法即可獲得滿足于RT-PCR反應(yīng)的RNA（只需少量的RNA便可進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)）。但為了保證實(shí)驗(yàn)的成功率，建議使用GTC法（異硫氰酸胍法）制備的高純度RNA。 | ||||||||
| 【RNA樣品量】 | ||||||||
| 使用本試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)時(shí)，每次反應(yīng)所需的最適Total RNA量約為500 ng。 | ||||||||
| 3. 使用注意 | ||||||||
| 以下為使用本試劑盒時(shí)的注意事項(xiàng)，使用前一定認(rèn)真閱讀。 | ||||||||
| 1). 當(dāng)同時(shí)需要進(jìn)行多個(gè)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)先配制各種試劑的混合液 (其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture、MgCl2等），然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中。這樣，可使所取的試劑體積更準(zhǔn)確，減少試劑損失，避免重復(fù)分取同一試劑。同時(shí)也可以減少實(shí)驗(yàn)操作或?qū)嶒?yàn)之間產(chǎn)生的誤差。 2) 使用Reverse Transcriptase（AMV）、RNase Inhibitor、TaKaRa LA Taq酶等酶類時(shí)，應(yīng)輕輕混勻，避免起泡。分取之前要小心地離心收集到反應(yīng)管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取時(shí)應(yīng)慢慢吸取。 3) 酶制品應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前才從-20℃中取出，使用后也應(yīng)立即放回-20℃中保存。 4) 分裝試劑時(shí)務(wù)必使用新的槍頭，以防止樣品間污染。 5) PCR反應(yīng)條件 最適的PCR條件因PCR擴(kuò)增儀的不同而不同，建議在進(jìn)行樣品實(shí)驗(yàn)前最好先試做一下Control實(shí)驗(yàn)。 |
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