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標(biāo)準(zhǔn)操作流程
TaKaRa RNA LA PCR™ Kit (AMV) Ver.1.1
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| ■ 操作流程 |
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| （1）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) |
| 1. 按下表所示制備反應(yīng)液。 |
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| 試劑 |
使用量 |
終濃度 |
| MgCl2 |
2 μl |
5 mM |
| 10 × RNA PCR Buffer |
1 μl |
1 × |
| RNase Free dH2O |
4.25 μl |
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| dNTP Mixture（各10 mM） |
1 μl |
各1 mM |
| RNase Inhibitor |
0.25 μl |
1 U/μl |
| AMV Reverse Transcriptase XL*1 |
0.5 μl |
0.25 U/μl |
Random 9 mers
or
Oligo dT-Adaptor Primer
or
特異性下游PCR Primer
(R-1 Primer) |
0.5 μl |
2.5 μM
or
0.125 μM
or
1 μM |
Positive Control RNA
or
Experimental Sample |
0.5 μl |
［1 ×105 copies］
or
［≤500 ng total RNA］ |
| Total |
10 μl/sample |
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| *1 由于AMV Reverse Transcriptase XL結(jié)合在cDNA上，如果直接進(jìn)行PCR反應(yīng)，會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生阻害作用。使用（1）-1的反應(yīng)液時(shí)，99℃，5分鐘使AMV Reverse Transcriptase XL失活，消除對(duì)于PCR反應(yīng)的阻害。如果Reverse Transcriptase的濃度增加，失活將會(huì)變得困難，因此，對(duì)于長(zhǎng)鏈RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，不要增加Reverse Transcriptase的量，建議延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。 |
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| 2. 反應(yīng)使用的引物可以在Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer、特異性下游PCR引物（Control RNA使用R-1 Primer）任意選擇。 |
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| 反應(yīng)液制備完成后將反應(yīng)管放于Thermal Cycler中，按照下述程序進(jìn)行反應(yīng)。 |
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| (30℃、10 min)*2 |
1 cycle |
| 42～60℃*3、15 min～30 min |
| 99℃、5 min*4 |
| 5℃、5 min |
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*2 使用Random 9 mers時(shí)，先進(jìn)行30℃保溫10 min，使Random 9 mers與樣品RNA在42～60℃充分退火延伸達(dá)到足夠長(zhǎng)度。
*3 AMV來(lái)源的Reverse Transcriptase在60℃也可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。但是如果高溫時(shí)反應(yīng)性不好時(shí)，建議使用42℃左右的溫度進(jìn)行反應(yīng)。
*4 擴(kuò)增長(zhǎng)鏈時(shí)，為避免在1st strand cDNA中產(chǎn)生nick，請(qǐng)70℃處理15 min使其失活。
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| （1）PCR反應(yīng) |
| 1. 按下表所示制備反應(yīng)液。 |
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| 試劑 |
使用量 |
終濃度 |
| MgCl2 |
3 μl |
2.5 mM |
| 10×LA PCR Buffer II（Mg+2 Free） |
4 μl |
1 × |
| 滅菌水 |
31.75 μl |
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| TaKaRa LA Taq |
0.25 μl |
12.5 U/50 μl |
| 上游PCR引物（Control RNA使用F-1 Primer） |
0.5 μl |
0.2 μM |
下游PCR引物*5
［Control RNA使用R-1 Primer、
或M13 M4 Primer
(反轉(zhuǎn)錄使用Oligo dT-Adaptor Primer時(shí))］ |
0.5 μl |
0.2 μM |
| Total |
40 μl/sample |
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| *5 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)如使用了特異性下游PCR引物，可用0.5 μl滅菌水代替下游PCR引物。 |
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2 將上述1.中的40 μl反應(yīng)液添加到（1）-2.的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成的反應(yīng)管中。
3. 輕微離心10秒鐘。
4. 反應(yīng)液制備完成后將反應(yīng)管放于Thermal Cycler中，選擇合適的程序進(jìn)行擴(kuò)增。
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| 94℃、2 min |
1 cycle |
| 94℃、30 sec |
25～35 cycles |
| 55～65℃、30 sec |
| 72℃、X min*6 |
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*6 按照約 1 kb/1 min設(shè)置。
引物Tm值高時(shí)，shuttle PCR (2 step PCR)也可以。 |
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| 94℃、2 min |
1 cycle |
| 94℃、30 sec |
25～35 cycles |
| 65～68℃、 X min*6 |
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| *6 68℃時(shí)，按照約1 kb/1 min設(shè)置。
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| 5 反應(yīng)結(jié)束后，取部分反應(yīng)液（5～10 μl）電泳，確認(rèn)反應(yīng)產(chǎn)物。至PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析前冷凍保存。 |
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| 表1 使用Control RNA得到的擴(kuò)增片段（bp） |
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| 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用引物 |
PCR primers |
擴(kuò)增片段 |
| Oligo dT-Adaptor Primer |
F-1和M13 Primer M4
或F-1和R-1 |
約1.2 kb
462 bp |
| Random 9 mers |
F-1和R-1 |
462 bp |
| Control R-1 Primer |
F-1和R-1 |
462 bp |
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| 圖1 Positive Control RNA：使用各引物擴(kuò)增時(shí)的片段 |
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| ■ PCR條件 |
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| · 退火溫度 |
| 使用Positive Control RNA時(shí)60℃反應(yīng)，實(shí)際樣品的反應(yīng)條件不同。長(zhǎng)鏈擴(kuò)增多使用長(zhǎng)度為25 mer左右的引物，因此通常在55～65℃的范圍內(nèi)研討適宜反應(yīng)溫度。 |
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| · 延伸時(shí)間 |
| 延伸時(shí)間需根據(jù)target的長(zhǎng)度設(shè)置。通常設(shè)置為68～72℃約1 kb/min。 |
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| · 循環(huán)圈數(shù) |
| cDNA量較少時(shí)，循環(huán)圈數(shù)可增加至40～50 cycles。 |
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