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3′-RACE法實驗例
 
樣品RNA：Human HL60 Total RNA
target DNA：Transferrin receptor（TFR）
擴增DNA片段大?。?105 bp
 
圖3. 3′-RACE法原理圖
 
A. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
① 按下列組成配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。
 
試劑 使用量 終濃度
 MgCl2 2 μl 5 mM
 10 × RNA PCR Buffer 1 μl 1 ×
 RNase Free dH2O 4.25 μl  
 dNTP Mixture 1 μl 1 mM
 RNase Inhibitor 0.25 μl 1 U/μl
 Reverse Transcriptase 0.5 μl 0.25 U/μl
 Oligo dT-Adaptor Primer 0.5 μl 0.125 μM
 HL60 total RNA(1 μg/μl) 0.5 μl 0.5 μg/10 μl RT
 Total 10 μl/sample  
 
② 按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
 
 30℃、10 min 1 cycle
 50℃、30 min
 95℃、2 min
 5℃、5 min
 
B. PCR
① 按下表所示制備反應(yīng)液。
 
試劑 使用量 終濃度
 MgCl2 3 μl 2.5 mM
 10×LA PCR Buffer II（Mg+2 Free） 4 μl 1 ×
 滅菌水 31.75 μl  
 TaKaRa LA Taq 0.25 μl 12.5 U/50 μl
 M13 Primer M4 0.5 μl 0.2 μM
 TFR-1 Primer 0.5 μl 0.2 μM
 Total 40 μl/sample  
 
② 把40 μl的B-①的反應(yīng)液加入到A-②的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后的PCR反應(yīng)管中，輕輕混勻。
 
③ 按以下條件進行PCR反應(yīng)。
 
 94℃、30 sec 30 cycles
 55℃、30 sec
 72℃、5 min
 
④ 反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl的PCR反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，確認得到了1,105 bp的目的擴增產(chǎn)物。