| 標(biāo)準(zhǔn)操作流程 TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ 操作注意 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 以下為使用該試劑盒時(shí)的注意事項(xiàng)。使用前請(qǐng)認(rèn)真閱讀 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| （1）反應(yīng)液的制備，可制備多次~10次反應(yīng)量的Master mix（RNase Free dH2O、buffer、dNTP Mixture、MgCl2等的混合液）。通過制備Master mix，能夠減少移液時(shí)的損失，減少試劑的分注、攪拌次數(shù)等，從而防止實(shí)驗(yàn)間的數(shù)據(jù)誤差。 （2） Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, AMV-Optimized Taq等酶類的混合請(qǐng)注意輕柔操作，不要產(chǎn)生氣泡。此外，吸打前將試劑輕微離心，使其集于反應(yīng)管的底部。尤其是酶類，由于含有50%的甘油溶液粘度很高，注意小心吸取。 （3） 酶類至使用前于-20℃保存，使用后請(qǐng)立即放回－20℃。 （4） 為防止Positive Control RNA分解，請(qǐng)盡量避免反復(fù)凍融。建議少量分裝多管進(jìn)行保存。另外，請(qǐng)盡量于－70～－80℃保存。 （5）分裝試劑時(shí)請(qǐng)盡量使用一次性tip，盡量避免樣品間的污染。 （6）使用本試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，必須使用特異性引物進(jìn)行，不能使用Random primer或Oligo dT primer。 |
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| 2. 反應(yīng)使用的引物可以在Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer、特異性下游PCR引物（Control RNA使用R-1 Primer）任意選擇。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ 各引物的序列 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 引物名稱 | 序列 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Contorol F-1 primer | 5'-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3' | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Contorol R-1 primer | 5'-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3' | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ Positive Control RNA | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 本試劑盒中的Control RNA是以pSPTet3質(zhì)粒 (質(zhì)粒中的SP6啟動(dòng)子下游插入長(zhǎng)約1.4 kb的pBR322來(lái)源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四環(huán)素基因) 為模板由SP6 RNA聚合酶經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄而得到的。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| ■ 關(guān)于RNA樣品的制備 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 想要成功合成cDNA，需要純度高的RNA樣品。因此，需要抑制細(xì)胞內(nèi)含有的RNase作用，此外，實(shí)驗(yàn)中使用的器具及溶液也應(yīng)避免RNase的混入。制備RNA時(shí)，為避免實(shí)驗(yàn)者的汗液及唾液中含有的RNase混入，實(shí)驗(yàn)過程中請(qǐng)盡量避免講話，并戴好干凈的一次性手套，盡量在RNA專用實(shí)驗(yàn)臺(tái)中操作。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| [器具] | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 關(guān)于實(shí)驗(yàn)器具，盡量使用一次性的塑料制品。常用的玻璃器具按照下述方法處理后再使用。 （1）玻璃器具在0.1%DEPC溶液中，37℃處理12小時(shí)。 （2）為去除殘存的DEPC，高壓滅菌（120℃、30分鐘）。 建議RNA實(shí)驗(yàn)中用到的器具（塑料制品及玻璃制品），與其他的器具分開放置，作為RNA專用器具。 |
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| [試劑] | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 實(shí)驗(yàn)中用到的試劑溶液，使用干熱滅菌（180℃、60分）后的玻璃器具制備，使用的滅菌水請(qǐng)用0.1％DEPC處理并滅菌后使用。RNA實(shí)驗(yàn)用到的試劑和滅菌水全部都應(yīng)專用。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| [RNA樣品的制備法] | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| RT-PCR法中用到的RNA樣品，通常僅少量的RNA也可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所以可以使用簡(jiǎn)便的純化方法進(jìn)行RNA的提取純化，但是仍建議使用GTC法（Guanidine thiocyanate法）從而得到高度的RNA。 組織、細(xì)胞中RNA的提取可以使用NucleoSpin RNA（Code No. 740955.50）或RNAiso Plus（Code No.9108／9109），能夠短時(shí)間內(nèi)制備得到高純度的total RNA。 |
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| ■ 操作方法 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 常用RT-PCR例 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| * 使用Positive Control RNA時(shí)：Control F-1 Primer ** 使用Positive Control RNA時(shí)：Control R-1 Primer *** RNA表達(dá)量少時(shí)：樣品最大加量為25 μl |
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| 2. 反應(yīng)液混合后，加入50～100 μl礦物油或AmpliWax覆蓋。（使用TaKaRa Thermal Cycler MP或Personal時(shí)不需要加） 將準(zhǔn)備好的反應(yīng)管置于Thermal Cycler中，按照下述程序進(jìn)行反應(yīng)。 常用的反應(yīng)條件〈使用Positive Control RNA時(shí)〉 |
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| 50℃〈50℃〉 30 min.〈15 min.〉 RT反應(yīng) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 94℃〈94℃〉 2 min.〈2 min.〉 RT反應(yīng) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 94℃〈94℃〉 30 sec.〈30 sec.〉 |  |
PCR反應(yīng)：25～30 cycles〈28 cycles〉 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 37～65℃〈60℃〉 30 sec.〈30 sec.〉 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 72℃〈72℃〉 1～10 min.〈1.5 min.〉 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 3. 反應(yīng)結(jié)束后、取部分反應(yīng)液（5～10 μl）進(jìn)行凝膠電泳，確認(rèn)反應(yīng)產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物冷凍保存。對(duì)照組能夠檢出462 bp的條帶。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ 關(guān)于PCR反應(yīng)條件 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| · 退火溫度 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Control RNA時(shí)，使用60℃反應(yīng);對(duì)于實(shí)驗(yàn)樣品，可在37～65℃溫度范圍內(nèi)對(duì)溫度進(jìn)行調(diào)整，使其為最適溫度。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| · 延伸時(shí)間 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 延伸時(shí)間依據(jù)目的基因的長(zhǎng)度設(shè)定。通常使用AMV-Optimized Taq時(shí)在 72 ℃下每 kb 設(shè)定時(shí)間在 1～2 min。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| · Cycle數(shù) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| cDNA量較少時(shí)，循環(huán)圈數(shù)可增加至40～50 cycles。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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