| 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中引物的選擇、RNA樣品的制備、操作注意事項 |
| 1. 關(guān)于反轉(zhuǎn)錄引物的選擇 |
| 用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實驗具體情況選擇Random 9 mers、Oligo dT Primer或特異性下游引物。對于不具有Hairpin構(gòu)造的短鏈mRNA，3種引物中的任何一種都可以使用，但一般應(yīng)按以下方法進行選擇。 |
| Oligo dT Primer： 適用于具有Poly(A)+ Tail的RNA。本Primer設(shè)計巧妙，反轉(zhuǎn)錄效率高。（注意：原核生物的RNA、真核生物的rRNA及tRNA以及某些種類的真核生物的mRNA不具有Poly (A)+）。 |
| Random 9 mers： 適用于長的或具有Hairpin構(gòu)造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在內(nèi)的所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)都可使用本引物。 |
| 特異性下游PCR Primer（PCR時的下游引物）： 因其必須與模板序列互補，所以只適用于Target序列已知的情況。 |
| 2. RNA樣品制備 |
| 本試劑盒是把RNA合成cDNA，然后再對此cDNA進行擴增的試劑盒。RNA的純度會影響cDNA的合成量，而制備RNA的關(guān)鍵是要抑制細胞中的RNA分解酶和防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。因此，在實驗中必須采取以下措施：戴一次性干凈手套；使用RNA操作專用實驗臺；在操作過程中避免講話等等。通過以上辦法可以防止實驗者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。 |
| 【使用器具】 |
| 盡量使用一次性塑料器具。若使用玻璃器具，應(yīng)在使用前按下列方法進行處理。 |
| （1） 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下處理12小時。 （2） 然后在120℃下高壓滅菌30分鐘以除去殘留的DEPC。 |
| RNA實驗用的器具和儀器建議專門使用，不要用于其它實驗。 |
| 【試劑配制】 |
| 用于RNA實驗的試劑，包括蒸餾水，須使用干熱滅菌（180℃，60 min.）或用上述方法進行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可使用RNA實驗用的一次性塑料容器），使用的滅菌水須用0.1%的DEPC處理后進行高溫高壓滅菌。 |
| RNA實驗用的試劑和滅菌水都應(yīng)專用，避免混用后交叉污染。 |
| 【制備方法】 |
| 使用簡單的RNA純化方法即可獲得滿足于RT-PCR反應(yīng)的RNA（只需少量的RNA便可進行RT-PCR反應(yīng)）。但為了保證實驗的成功率，建議使用GTC法（異硫氰酸胍法）制備的高純度RNA。 使用NucleoSpin RNA（Code No. 740955.10）或RNAiso Plus（Code No. 9108/9109），可從組織、細胞中快速提取高純度的Total RNA。 使用本試劑盒進行RT-PCR反應(yīng)時，每次反應(yīng)所需的最適Total RNA量約為500 ng。 |
| 【RNA樣品量】 |
| 使用本試劑盒進行RT-PCR反應(yīng)時，每次反應(yīng)所需的最適Total RNA量約為500 ng。 |
| 3. 使用注意事項 |
| 以下為使用本試劑盒時的注意事項，使用前一定認真閱讀。 |
| 1). 當(dāng)同時需要進行數(shù)次反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或PCR反應(yīng)時，應(yīng)先配制各種試劑的混合液（Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture、MgSO4等），然后再分裝到每個反應(yīng)管中。這樣，可使所取的試劑體積更準(zhǔn)確，減少試劑損失，避免重復(fù)分取同一試劑。同時也可以減少實驗操作或?qū)嶒炛g產(chǎn)生的誤差。 2) 使用BcaBEST Polymerase、RNase Inhibitor、Bca-Optimized Taq等酶類時，應(yīng)輕輕混勻，避免起泡；分取之前要小心地離心收集到反應(yīng)管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取時應(yīng)慢慢吸取。 3) 酶制品應(yīng)在實驗前才從-20℃中取出，使用后也應(yīng)立即放回-20℃中保存。 4) 為了防止Positive Control RNA分解，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。有條件的實驗室最好保存于 -70℃～-80℃。 5) 分裝試劑時務(wù)必使用新的槍頭（Tip），以防止樣品間污染。 |
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