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標(biāo)準(zhǔn)操作流程
BcaBEST™ RNA PCR Kit Ver.1.1
 
■ 操作流程
 
A. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
1. 按下表所示制備反應(yīng)液。
 
試劑 使用量 終濃度
 MgSO4 (25 mM) 2 μl 5 mM
 2×Bca 1st Buffer 5 μl 1 ×
 RNase Free dH2O 0.75 μl  
 dNTP Mixture（各10 mM） 0.5 μl 0.5 mM
 RNase Inhibitor 0.25 μl 1 U/μl
 BcaBEST polymerase(22 U/μl) 0.5 μl 1.1 U/μl
 Random 9 mers
         or
 Oligo dT Primer
         or
 特異性下游PCR Primer
 (R-1 Primer) 		0.5 μl 2.5 μM
or
0.125 μM
or
1 μM
 Positive Control RNA
         or
 實(shí)驗(yàn)樣品 RNA 		0.5 μl ［1 ×105 copies］
or
［≤500 ng total RNA］
 Total 10 μl/sample  
 
* 實(shí)驗(yàn)樣品是表達(dá)量低的RNA時(shí)，樣品體積可增至1.25 μl。
 
2. A. -1中反應(yīng)液充分混合后，加入礦物油覆蓋。
（使用TaKaRa Thermal Cycler Dice、GP、SP、MP、PERSONAL時(shí)不需要添加）
反應(yīng)用引物可以使用Random 9 mers、Oligo dT Primer、特異性下游PCR引物（Positive control RNA時(shí)使用Control R-1 Primer ）中任意一個(gè)。
 
制備完成的反應(yīng)管置于Thermal Cycler中，按下述程序進(jìn)行反應(yīng)。
 
 
B. PCR反應(yīng)
1. 按下表所示制備反應(yīng)液。
 
試劑 使用量 終濃度
 MgSO4 (25 mM) 3 μl 2.5 mM
 5 × Bca 2nd Buffer 8 μl 1 ×
 Bca-Optimized Taq 0.25 μl 12.5 U/50 μl
 上游PCR引物（20 μM）
（Control RNA使用F-1 Primer）		 0.5 μl 0.2 μM

 下游PCR引物（20 μM）
 (Control RNA時(shí)使用R-1 Primer)

0.5 μl 0.2 μM
 滅菌水 27.75 μl  
 Total 40 μl/sample  
 
1'. 按上述條件反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)如未得到擴(kuò)增產(chǎn)物，可以嘗試使用以下的反應(yīng)組成，可以改善條件。
 
試劑 使用量 終濃度
 MgSO4 (25 mM) 3 μl 2.5 mM
 2 × Bca 1st Buffer 20 μl 1 ×
 Bca-Optimized Taq 0.25 μl 12.5 U/50 μl
 上游PCR引物（20 μM） 0.5 μl 0.2 μM

 下游PCR引物（20 μM）

0.5 μl 0.2 μM
 滅菌水 15.75 μl  
 Total 40 μl/sample  
 
2. 取1.的反應(yīng)液40 μl加入到A-2.反轉(zhuǎn)錄結(jié)束的反應(yīng)管中。
3. 輕微離心約10秒鐘。
4. 制備好后的反應(yīng)管置于Thermal Cycler中，使用合適的程序進(jìn)行擴(kuò)增。
 
常用的反應(yīng)條件
 
 94℃  30 sec 25～30 cycles
 37～65℃  30 sec
 72℃  1～10 min
 72℃  5 min  
 
Positive Control RNA反應(yīng)條件
 
 94℃  30 sec 28 cycles
 60℃  30 sec
 72℃  1 min
 
5. 反應(yīng)結(jié)束后，取部分反應(yīng)液（5～10 μl）進(jìn)行凝膠電泳，確認(rèn)反應(yīng)產(chǎn)物。
PCR反應(yīng)產(chǎn)物至分析使用前冷凍保存。
 
■ Positive Control RNA的擴(kuò)增產(chǎn)物大小
 
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用引物 PCR primers 擴(kuò)增片段
 Oligo dT Primer

Control F-1Primer
&
Control R-1 Primer

 462 bp
 Random 9 mers
 R-1 Primer