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含有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的目的基因的擴(kuò)增
 
■ 方法
Target：GFR II 基因516 bp（GC含量63.5%） 
樣 品：人骨骼肌來源的全RNA 5 μg/RT液20 μl 
 
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的制備
 
試劑 使用量
 2×Bca 1st Buffer 10 μl
 MgSO4 (25 mM) 4 μl
 dNTP Mixture（10 mM） 1 μl
 RNase Inhibitor 0.5 μl
 BcaBEST polymerase 1 μl
 Oligo dT Primer 1 μl
 樣品RNA 1 μl
 RNase Free dH2O 1.5 μl
 Total 20 μl
 
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件
 
 65℃  1 min 1 cycle
 30℃  5 min
 ↓  15 min
 65℃  15 min
 98℃  5 min
 5℃  5 min
 
 
PCR反應(yīng)
 
A法（普通方法）
試劑 使用量
 MgSO4 (25 mM) 6 μl
 5 × Bca 2nd Buffer 16 μl
 Bca-Optimized Taq 0.5 μl
 上游PCR引物 1 μl

 下游PCR引物

1 μl
 滅菌水 55.5 μl
 Total 80 μl
 
B法
試劑 使用量
 MgSO4 (25 mM) 6 μl
 2×Bca1st Buffer 40 μl
 Bca-Optimized Taq 0.5 μl
 上游PCR引物 1 μl

 下游PCR引物

1 μl
 滅菌水 31.5 μl
 Total 80 μl
 
分別添加上述反應(yīng)液（80 μl）和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的產(chǎn)物（20μl）按照以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。 
 
PCR反應(yīng)條件
 
 94℃  1 min  
 94℃  30 sec 40 cycles
 60℃  30 sec
 72℃  1 min
 72℃  5 min  
 
■ 結(jié)果
使用A法（普通方法）未能得到擴(kuò)增產(chǎn)物，但使用B法能夠得到擴(kuò)增產(chǎn)物。