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標(biāo)準(zhǔn)流程（Code No. R026A/B）
 
1. 按下表所示制備反應(yīng)液
 
試劑 使用量 終濃度
 2×One Step High Fidelity Buffer 25 μl 1 ×
 PrimeScript II RT Enzyme Mix 1 μl  
 PrimeSTAR GXL for 1 step RT-PCR 4 μl  
 上游 Primer（20 μM）（sense） 1 μl 0.4 μM
 下游Primer（20 μM）antisense） 1 μl 0.4 μM
 Template RNA*1 *1  
 RNase Free dH2O up to 50 μl  
 
*1 使用total RNA時(shí)推薦加量10～1000 ng。
   使用Positive Control RNA時(shí)加1 μl。
 
2. 制備好的反應(yīng)管置于Thermal Cycler, 選擇合適的程序進(jìn)行RT-PCR。
 
常用的反應(yīng)條件
                45℃*2     10 min
                94℃       2 min
                       ↓
                98℃      10 sec 30 cycles
        60 or 55℃*3      15 sec
                68℃      10 sec/kb*4
 
*2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度
使用PrimeScript II RTase(PrimeScript II RT Enzyme Mix中含有)可以提高反應(yīng)特異性，使用特異性下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，可在45°C進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，不會(huì)引起RNA的降解及酶的失活。擴(kuò)增超過(guò)6 kb的長(zhǎng)鏈DNA時(shí)，通過(guò)將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至15分鐘，可以提高cDNA的合成量。
*3 退火溫度
引物的Tm值（按以下公式計(jì)算）在55℃以上時(shí)，設(shè)定為60℃
引物的Tm值（按以下公式計(jì)算）在55℃以下時(shí)，設(shè)定為55℃
※Tm值計(jì)算方法
Tm值（℃）＝［（A、T數(shù)）×2］＋［（G、C數(shù)）×4］－5
*4 延伸時(shí)間按照1 kb用時(shí)10 sec設(shè)定。但是，不足1 kb時(shí)設(shè)定為10 sec.