| In-Fusion Cloning：高效的單片段和多片段克隆方法 |
| 【數(shù)據(jù)提供】Dr. Samuel Bru Postdoc, Orphan Cyclins Group Universitat Internacional de Catalunya |
| 【實驗簡介】 |
| Dr. Josep Clotet課題組的Dr. Samuel Bru及其同事定期從釀酒酵母中純化重組嵌合蛋白質(zhì)；該小組試圖尋找一種快速、簡便的方法來克隆其工作所需的嵌合蛋白質(zhì)。在這項研究中，使用了In-Fusion克隆和基于連接酶的克隆兩種方法來平行測試克隆單個和多個插入片段的效果，分別克隆一個，兩個或三個插入片段。通過限制酶消化篩選菌落，克隆效率為從10個隨機選擇的菌落中獲得的陽性克隆的數(shù)量，在5個獨立實驗中取平均值。 |
| 通過直接比較兩種克隆方法的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)由于傳統(tǒng)T4 DNA連接酶的克隆方法效率低，一步法克隆多片段是非常困難的。然而，當(dāng)用In-Fusion克隆進行實驗時，該方法對于單片段插入和多片段插入反應(yīng)都是高效的，并且在較短的時間內(nèi)完成，操作步驟也更少。 |
| 【用戶感言】 |
| “總之，與傳統(tǒng)的基于連接酶的克隆方法相比，無論單片段還是多片段克隆，In-Fusion HD克隆試劑盒都為我們提供了更高的克隆效率和更快的結(jié)果。” -Dr. Samuel Bru |
| 【實驗結(jié)果】 |
| 對于In-Fusion克隆，設(shè)計引物使插入片段具有與相鄰DNA片段重疊的末端（插入片段和載體之間或插入片段與片段之間，參見圖1）。對于連接酶的克隆方法，設(shè)計插入片段與相鄰片段具有相容的限制酶位點（插入片段和載體之間或插入片段與片段之間。所有插入片段都需要進行PCR擴增和純化，但使用連接酶方法時，插入片段在克隆前需要用合適的限制酶進行消化。 對每種克隆方法都設(shè)置了一個、兩個或三個插入片段的克隆反應(yīng)（參見圖1和圖2），設(shè)計克隆兩個和三個插入片段的反應(yīng)時，所有DNA片段是一步法克隆到表達載體中。在所有實驗中，最終質(zhì)粒均為~6.8 kb。通過限制酶消化鑒定陽性克隆，進行5次獨立實驗，從10個隨機選擇的克隆中陽性克隆的數(shù)量取平均數(shù)以確定克隆效率（圖2）。 In-Fusion克隆在所有測試條件下都是成功的，單個和多個插入片段實驗都可以得到高克隆效率。相比之下，連接酶方法克隆效率較低，特別是多片段克隆反應(yīng)。 |
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| 圖1. 使用In-Fusion克隆和基于T4 DNA連接酶的方法進行單片段和多片段克隆反應(yīng)的示意圖。插入片段以線性形式顯示; 載體以環(huán)形顯示。In-Fusion克隆所需的相鄰DNA片段（插入片段和載體之間或插入片段與片段之間）之間的15 bp重疊以不同的顏色顯示。在傳統(tǒng)連接酶方法的情況下，顏色代表不同的粘性末端。 |
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| 圖2. 使用In-Fusion克隆和基于連接酶的克隆方法進行單片段和多片段克隆反應(yīng)的克隆效率定量比較。圖A.所有三種克隆反應(yīng)類型的平均克隆效率的柱型圖。結(jié)果對應(yīng)于五個獨立實驗的平均值±SEM。星號表示使用Mann-Whitney U檢驗計算的顯著差異，***表示p值<0.0005。 圖B.對于五個單獨的實驗中的每一個列出了克隆效率，并且列出了每種克隆反應(yīng)類型的平均效率。 |
| 【結(jié)論】 |
| In-Fusion技術(shù)在單片段插入和多片段插入克隆實驗中，結(jié)果均優(yōu)于傳統(tǒng)的基于連接酶的克隆方法。雖然連接酶方法對單片段插入的克隆效率為76％，但多片段克隆的效率顯著下降，兩個和三個片段克隆反應(yīng)效率分別為2％和0％。相比之下，In-Fusion克隆對于單片段克隆的效率為96％，并且對于雙片段和三片段克隆也顯示出良好的克隆效率，分別為78％和42％。總體而言，就效率、步驟數(shù)和所有三種反應(yīng)類型的處理時間而言，In-Fusion技術(shù)被證明是一種更簡單、更快速的克隆方法。 |
| 詳細實驗方法和步驟請見： |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/single-and-multiple-insert-cloning |
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