| In-Fusion Cloning：簡(jiǎn)單的多片段克隆解決一個(gè)合成的難題 |
| 【數(shù)據(jù)提供】Christian Joerg Braun Postdoc, MIT |
| 【實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介】 |
| 在該研究中，使用In-Fusion克隆將轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的多個(gè)重疊片段快速克隆到Cas9-dead病毒表達(dá)載體中。插入該結(jié)構(gòu)域的目的是改善轉(zhuǎn)錄基因激活的量。由于激活結(jié)構(gòu)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)，無(wú)法直接合成整個(gè)序列，并且，如果使用傳統(tǒng)的基于連接酶的方法以多個(gè)片段構(gòu)建該結(jié)構(gòu)域又沒(méi)有合適的限制酶位點(diǎn)。相反，應(yīng)用In-Fusion技術(shù)可以把該結(jié)構(gòu)域的兩段序列合成后在一個(gè)反應(yīng)中完成克隆，無(wú)需擔(dān)心限制酶位點(diǎn)的兼容性。將全長(zhǎng)序列無(wú)縫克隆到表達(dá)載體中，通過(guò)限制酶消化和Sanger測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。最終載體構(gòu)建在三天內(nèi)完成，手動(dòng)操作時(shí)間總計(jì)僅兩個(gè)多小時(shí)。 |
| 【用戶(hù)感言】 |
| “In-Fusion克隆的速度、準(zhǔn)確性和易用性使我確信再次購(gòu)買(mǎi)該產(chǎn)品。” -Christian Joerg Braun |
| 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 |
| 通過(guò)單酶切將準(zhǔn)備好的Cas9表達(dá)構(gòu)建體線(xiàn)性化并凝膠純化。設(shè)計(jì)兩個(gè)合成的插入片段，使片段末端之間以及和載體末端帶有重疊的區(qū)域。將兩個(gè)插入片段同時(shí)克隆到線(xiàn)性化的表達(dá)載體中，并用該反應(yīng)液轉(zhuǎn)化附帶的感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)限制酶消化進(jìn)行菌落篩選，并通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)陽(yáng)性克隆。在篩選的9個(gè)菌落中，6個(gè)顯示正確的酶切結(jié)果（下圖）和測(cè)序結(jié)果。 |
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| 圖1. 酶切確認(rèn)陽(yáng)性克隆。通過(guò)EcoR I酶切進(jìn)行轉(zhuǎn)化菌落的篩選。結(jié)果顯示在檢測(cè)的9個(gè)菌落中有6個(gè)陽(yáng)性菌落。3個(gè)陰性菌落是載體自連。數(shù)據(jù)圖片由Christian Braun提供。 |
| 【用戶(hù)感言】 |
| “我沒(méi)有嘗試過(guò)任何其他克隆方法用于本實(shí)驗(yàn)，而是直接測(cè)試了In-Fusion克隆方法。限制酶位點(diǎn)的可用性是這個(gè)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)問(wèn)題，我很高興In-Fusion克隆不需要依賴(lài)限制酶位點(diǎn)。” -Christian Joerg Braun |
| 【結(jié)論】 |
| 利用In-Fusion技術(shù)，僅通過(guò)一個(gè)克隆反應(yīng)就將兩個(gè)合成的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域序列克隆到Cas9表達(dá)載體中，成功率為～67％。激活結(jié)構(gòu)域二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行全長(zhǎng)序列合成，而將序列分成兩部分又沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)，無(wú)法使用傳統(tǒng)連接酶方法進(jìn)行克隆。In-Fusion Cloning能夠在三天內(nèi)生成最終的陽(yáng)性克隆，無(wú)需被限制酶位點(diǎn)或后續(xù)的一系列克隆反應(yīng)所困擾。 |
| 詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法和步驟請(qǐng)見(jiàn)： |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/solve-a-synthesis-challenge-with-easy-multiple-insert-cloning |
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