| In-Fusion Cloning：連接酶的高效率高準確度替代方法 |
| 【數(shù)據(jù)提供】 研究1: Ti-yu Lin, Graduate Student, Univ. of Wisconsin-Madison 研究2: Madhusudan Rajendran, Research Assistant, Univ. of Wisconsin-Madison |
| 【實驗簡介】 |
| 在下面這些研究中，In-Fusion Cloning被用于傳統(tǒng)連接酶方法不成功的克隆實驗。兩個實驗都使用了pET載體，這是一種常用的體內(nèi)重組蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。當使用連接酶時，兩位研究人員都無法克隆獲得想要的片段：Ti-yu Lin的目的片段為~1 kb并高GC含量（67％GC），Madhusudan Rajendran使用編碼novobiocin抗性的大插入片段（gyrase B; 2.4 kb）。 |
| 使用In-Fusion克隆，兩位科學家都能夠有效地將其片段克隆到限制酶消化的線性化載體中，通過菌落PCR篩選確定陽性克隆。雖然每個項目的具體細節(jié)都有不同的挑戰(zhàn)，但結(jié)果是相同的：In-Fusion技術(shù)在第一次嘗試時就產(chǎn)生了陽性克隆，并且手動操作時間很短。 |
| 【實驗結(jié)果】 |
| PCR擴增目的片段顯示了兩個正確大小的單一條帶（圖1），將這些片段克隆到它們各自的目的載體中（圖2）， 隨后通過菌落PCR分析。對于研究1，由In-Fusion克隆方法產(chǎn)生的10個菌落中的8個是陽性克隆。對于研究2，32個篩選的菌落中有21個是陽性克隆。在這兩種情況下，研究人員都能夠成功地將目的基因進行克隆。 |
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| 圖1. 目的片段的PCR擴增。使用CloneAmp HiFi PCR Premix從基因組DNA模板擴增目的基因。 PCR引物將In-Fusion Cloning重疊序列引入到PCR產(chǎn)物的5'和3'末端。（圖A）研究1，插入片段~1 kb插入。（圖B）研究2，插入片段2.4 kb。 |
| 【用戶感言】 |
| “這個試劑盒的效果超出我們的預期。PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收了高濃度DNA（~90 ng /μl）。 此外，我使用常規(guī)連接方法沒能獲得任何陽性克隆，而使用In-Fusion克隆，我能夠獲得21個陽性克隆。謝謝你們的幫助！” -Madhusudan Rajendran, UNIV. OF WISCONSIN-MADISON |
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| 圖2. 菌落篩選。菌落PCR用于確定陽性克隆。（圖A）在研究1中，檢測的10個菌落中有8個顯示~1.3 kb的條帶，為陽性克隆。（圖B）在研究2中，檢測的32個菌落中的21個顯示~2.6 kb的條帶，為陽性克隆。 |
| 【結(jié)論】 |
| 先前基于連接酶方法的克隆工作未能產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果，但使用In-Fusion HD Cloning Plus后，兩個獨立的項目都得到了陽性克隆。在每次嘗試中，兩位研究人員都能夠成功地將其具有挑戰(zhàn)性的插入片段克隆到pET表達載體中。 |
| 詳細實驗方法和步驟請見： |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/a-successful-alternative-to-ligation-cloning |
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