| In-Fusion Cloning: 克服慢病毒載體酶切位點(diǎn)的限制 |
| 【數(shù)據(jù)提供】Jun Yang Instructor, University of Texas Medical Branch |
| 【客戶心得】 |
| “我現(xiàn)在的課題完全沒有使用連接酶的克隆方法，但嘗試使用In-Fusion之前做過很多連接酶方法的克隆實(shí)驗(yàn)。二者的主要區(qū)別在于傳統(tǒng)方法需要的TA克隆、轉(zhuǎn)化、純化、消化、連接等步驟，至少要增加3個(gè)工作日的時(shí)間。通常我們每個(gè)實(shí)驗(yàn)需要篩選至少9個(gè)克隆，In-Fusion克隆可以達(dá)到70–80%的陽性率，所以In-Fusion方法是一個(gè)非常方便、可靠和快速的方法”。 —Jun Yang, University of Texas Medical Branch |
| 【實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介】 |
| 在本實(shí)驗(yàn)中，使用了In-Fusion Cloning克隆了5個(gè)PCR片段到一個(gè)慢病毒載體上，用于真核表達(dá)。這個(gè)載體只有一個(gè)可用于亞克隆的酶切位點(diǎn)，所以使用傳統(tǒng)PCR連接酶的克隆方法非常困難且耗費(fèi)時(shí)間，而In-Fusion方法使消除這些局限性成為可能。使用高保真酶擴(kuò)增每個(gè)插入片段后直接插入到慢病毒載體上，通過限制酶酶切消化來確認(rèn)陽性克隆。3天就得到最終的載體，每天僅需2-3小時(shí)的動(dòng)手操作時(shí)間。 |
| 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 |
| 5個(gè)從～400 bp 到1.6 kb大小不等的片段，經(jīng)PCR擴(kuò)增后帶有了特異的5' 和 3'末端，分別克隆到約8 kb的慢病毒載體上。每個(gè)PCR反應(yīng)都得到了特異性很好很亮的單一條帶，通過In-Fusion克隆將目的片段克隆到線性載體，并轉(zhuǎn)化到試劑盒自帶的高效率Stellar感受態(tài)細(xì)胞中。通過酶切篩選3-5個(gè)克隆確認(rèn)得到陽性菌落（圖1）。 |
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| 圖1. 酶切確認(rèn)陽性克隆。通過Xba I/EcoR I酶切消化篩選克隆子，結(jié)果顯示，篩選了5個(gè)獨(dú)立的克隆實(shí)驗(yàn)的18個(gè)克隆子，僅有一個(gè)為陰性克?。‥1）。 |
| 【結(jié)論】 |
| 利用In-Fusion Cloning 以接近100%的成功率構(gòu)建了五個(gè)陽性慢病毒克隆。無需為每個(gè)插入片段修改PCR條件，可以高效率地直接克隆到大載體上?？寺∥稽c(diǎn)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇，不再受到限制酶酶切位點(diǎn)的限制。僅需篩選很少的菌落即可得到陽性菌落，說明In-Fusion準(zhǔn)確率是很高的。在三天內(nèi)就完成了載體的構(gòu)建，每天僅需要2-3小時(shí)動(dòng)手操作時(shí)間。 |
| 詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法和步驟請(qǐng)見： |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/easy-cloning-into-lentiviral-vectors |
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