| In-Fusion Cloning：成功地直接克隆大的表達(dá)載體 | |
| 【數(shù)據(jù)提供】Ansul Lokdarshi Graduate Research Assistant, University of Knoxville, TN |
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| 【實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介】 | |
| 下面實(shí)驗(yàn)中使用了In-Fusion Cloning構(gòu)建植物中YFP標(biāo)簽蛋白質(zhì)定位研究的正對(duì)照載體。無(wú)需傳統(tǒng)連接方法的亞克隆操作，我們直接將黃色熒光蛋白質(zhì)（YEP）克隆到一個(gè)植物雙向載體上，啟動(dòng)子為花椰菜花葉病毒雙35S啟動(dòng)子（CaMV D35S）。通過(guò)限制酶酶切和測(cè)序來(lái)篩選確認(rèn)陽(yáng)性克隆。從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到完成、確認(rèn)克隆，整體時(shí)間比連接酶的方法少了兩天。 | |
| 【結(jié)果】 | |
| PCR擴(kuò)增獲得包含目標(biāo)載體5’和3’末端序列的插入片段（圖1），PCR生成了一個(gè)單一的清晰的正確大小條帶（圖2左側(cè)）。利用In-Fusion酶將插入片段克隆到線性表達(dá)載體上，檢測(cè)3個(gè)克隆均為陽(yáng)性克隆，對(duì)其中一個(gè)克隆通過(guò)限制酶作圖確認(rèn)（圖2右側(cè)）。最終構(gòu)建的質(zhì)粒長(zhǎng)度約9.5 kb，一次克隆實(shí)驗(yàn)即成功了。 | |
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圖1.構(gòu)建后的載體圖示。最終的載體是一個(gè)表達(dá)載體，用于植物研究，YFP與D35S啟動(dòng)子在同一閱讀框中 |
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| 圖2. 得到了單一清晰條帶，并以100%的準(zhǔn)確率克隆至線性載體上。左圖，插入片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果。使用CloneAmp HiFi PCR premix擴(kuò)增了YFP（740 bp）片段。引物引入了適用于In-Fusion克隆的5'-和 3'-末端。右圖，構(gòu)建質(zhì)粒用限制酶消化后的電泳圖。使用Nco I 和Xba I酶切質(zhì)粒，得到與預(yù)期大小一致的條帶。 | |
| 【結(jié)論】 | |
| In-Fusion Cloning僅通過(guò)一次克隆實(shí)驗(yàn)，即完成了陽(yáng)性表達(dá)載體的構(gòu)建，達(dá)到了100%的成功率。不需要亞克隆，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到完成確認(rèn)比傳統(tǒng)連接酶的方法減少了兩天。 | |
| 詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法和步驟請(qǐng)見(jiàn)： | |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/direct-cloning-into-large-vectors | |
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