| 利用In-Fusion Cloning插入小的融合蛋白質(zhì)標簽 |
| 【數(shù)據(jù)提供】Fabio Antenucci Post-doctoral research fellow, Veterinary Clinical Microbiology, University of Copenhagen |
| 【產(chǎn)品亮點】 |
| · 克服了限制酶位點的限制 · 無需標簽模板也可添加小的蛋白質(zhì)標記(<10 aa) · 一步反應將多個片段和標簽插入到載體中 |
| 【實驗簡介】 |
| 融合蛋白質(zhì)標簽是小的肽鏈，可以用于檢測、純化、確認目的蛋白質(zhì)。為了生成標簽蛋白質(zhì)，需要通過基因工程將標簽蛋白質(zhì)的序列插入到目的蛋白質(zhì)序列前，這樣通過表達重組蛋白質(zhì)來獲得順式標簽。 標簽重組蛋白質(zhì)的設計通常需要依賴限制酶的傳統(tǒng)克隆方法。這個方法需要一個供體模板來擴增所選擇的標簽序列和多個克隆實驗步驟。而不依賴限制酶的克隆方法的出現(xiàn)大大地簡化了這個流程，讓小標簽重組蛋白質(zhì)的基因操作在一步反應中就可以完成，且標簽序列不需要模板。 本實驗例中，使用了In-Fusion HD Cloning Plus構(gòu)建了包含來自兩個不同模板蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的重組嵌合體，并從頭插入了融合標簽A-4 (Zhou et al. 2008; Figure 1)。 |
 |
| 圖1. 實驗例中重組載體構(gòu)建的原理圖。紅色字母表示引物A和引物B的5’端互補區(qū)域。A-4標簽的全序列在粉色框中突出顯示。 |
| 【用戶感言】 |
| “In-Fusion真正地幫助我按時間期限完成研究，按照說明書的要求設計引物并使用推薦的條件，我獲得了接近100%的成功率。 —Fabio Antenucci, University of Copenhagen |
| 【結(jié)果】 |
| 目標序列的高效率插入且未檢測到脫靶效應 為了構(gòu)建圖1中的重組載體（圖1），設計了三對PCR引物，用于生成帶有重疊部分的擴增子并后續(xù)測序（圖2）。挑取了3個包含插入片段的克隆，并檢測圖2標出的目標序列的整合、突變、基因重排的情況。測序結(jié)果證明了三個克隆均整合了目標重組開放閱讀框A-A4-B，并沒有突變和基因重排的情況。 |
 |
| 圖2. 用于確認重組載體上正確開放閱讀框的測序策略。設計了三對引物，用于生成測序用的三個重疊擴增子，進一步確認結(jié)構(gòu)域A和B處于A-4標簽的兩端的正確順序。 |
| 【結(jié)論】 |
| 構(gòu)建標簽融合蛋白質(zhì)是比較耗費時間的工作，需要按順序進行多個亞克隆步驟來向每個載體插入目標片段。而用In-Fusion Cloning獲得了100%的相對效率（3/3陽性克?。?，證明了In-Fusion Cloning方法確實是一步法克隆插入小融合標簽的快速有效的方法。 |
| 詳細實驗方法和步驟請見： |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/de-novo-insertion-of-small-fusion-protein-tags |
京公網(wǎng)安備 110114000405號