| In-Fusion Cloning：更快速地得到比TOPO克隆更準確的結(jié)果 |
| 【數(shù)據(jù)提供】Juanita Von Dwingelo Ph.D. Candidate, University of Louisville |
| 【實驗簡介】 |
| Juanita Von Dwingelo和她的同事一直在通過酵母雙雜交研究目的蛋白質(zhì)和宿主蛋白質(zhì)之間的相互作用。TOPO克隆方法已成為克隆這些目的蛋白質(zhì)的標準工作流程的一部分，然而，TOPO克隆方法卻導致了克隆實驗花費時間長并且結(jié)果通常不可靠。當他們嘗試使用In-Fusion Cloning構(gòu)建質(zhì)粒時，他們發(fā)現(xiàn)獲得陽性克隆結(jié)果所花費的時間減少了兩天，并得到了100％的克隆效率。 |
| 【用戶感言】 |
| “我們的實驗室主要使用一種耗時很長且結(jié)果不可預(yù)測的方法將目的蛋白質(zhì)克隆到不同的載體中。以前我們使用過TOPO方法。。。 這是一個相對冗長的過程，從開始到結(jié)束平均需要五天。我們的實驗室進行了相當多的克隆，因此找到一種更快捷的克隆方法會很有用。” -Juanita Von Dwingelo |
| 【結(jié)果】 |
| 使用BamH I和Sal I雙酶切將酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7線性化，從嗜肺軍團菌中PCR擴增真核樣錨蛋白質(zhì)效應(yīng)子AnkH，使用引物在PCR產(chǎn)物末尾加入線性化載體末端序列。凝膠純化PCR擴增產(chǎn)物，定量后與線性化載體進行In-Fusion克隆反應(yīng)，反應(yīng)液轉(zhuǎn)化試劑盒中包含的感受態(tài)細胞，菌落PCR鑒定陽性克隆?？寺》桨傅目倳r間為3天，檢測的10個菌落中有10個含有正確的插入片段。 |
| 【用戶感言】 |
| “我肯定會再次使用[In-Fusion Cloning]，因為與其他克隆方法相比，這是一個非常簡單快速的過程，而其他方法需要更多的時間，而且不那么可靠。” -Juanita Von Dwingelo |
| 【結(jié)論】 |
| In-Fusion技術(shù)改進了酵母雙雜交實驗中目的蛋白質(zhì)克隆的工作流程，提高了克隆速度和準確性。觀察到的克隆效率為100％，而之前使用的TOPO克隆方法效率僅為50-75％。此外，使用In-Fusion系統(tǒng)進行克隆所花費的時間更少，之前方法需五天時間，而In-Fusion三天內(nèi)就完成了目的載體的構(gòu)建。 |
| 詳細實驗方法和步驟請見： |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/outperforming-topo-cloning |
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