| In-Fusion Cloning：連接酶的高效率高準(zhǔn)確度替代方法 |
| 【數(shù)據(jù)提供】 研究1: Ti-yu Lin, Graduate Student, Univ. of Wisconsin-Madison 研究2: Madhusudan Rajendran, Research Assistant, Univ. of Wisconsin-Madison |
| 【實(shí)驗(yàn)簡介】 |
| 在下面這些研究中，In-Fusion Cloning被用于傳統(tǒng)連接酶方法不成功的克隆實(shí)驗(yàn)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)都使用了pET載體，這是一種常用的體內(nèi)重組蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)使用連接酶時(shí)，兩位研究人員都無法克隆獲得想要的片段：Ti-yu Lin的目的片段為~1 kb并高GC含量（67％GC），Madhusudan Rajendran使用編碼novobiocin抗性的大插入片段（gyrase B; 2.4 kb）。 |
| 使用In-Fusion克隆，兩位科學(xué)家都能夠有效地將其片段克隆到限制酶消化的線性化載體中，通過菌落PCR篩選確定陽性克隆。雖然每個(gè)項(xiàng)目的具體細(xì)節(jié)都有不同的挑戰(zhàn)，但結(jié)果是相同的：In-Fusion技術(shù)在第一次嘗試時(shí)就產(chǎn)生了陽性克隆，并且手動(dòng)操作時(shí)間很短。 |
| 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 |
| PCR擴(kuò)增目的片段顯示了兩個(gè)正確大小的單一條帶（圖1），將這些片段克隆到它們各自的目的載體中（圖2）， 隨后通過菌落PCR分析。對于研究1，由In-Fusion克隆方法產(chǎn)生的10個(gè)菌落中的8個(gè)是陽性克隆。對于研究2，32個(gè)篩選的菌落中有21個(gè)是陽性克隆。在這兩種情況下，研究人員都能夠成功地將目的基因進(jìn)行克隆。 |
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| 圖1. 目的片段的PCR擴(kuò)增。使用CloneAmp HiFi PCR Premix從基因組DNA模板擴(kuò)增目的基因。 PCR引物將In-Fusion Cloning重疊序列引入到PCR產(chǎn)物的5'和3'末端。（圖A）研究1，插入片段~1 kb插入。（圖B）研究2，插入片段2.4 kb。 |
| 【用戶感言】 |
| “這個(gè)試劑盒的效果超出我們的預(yù)期。PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收了高濃度DNA（~90 ng /μl）。 此外，我使用常規(guī)連接方法沒能獲得任何陽性克隆，而使用In-Fusion克隆，我能夠獲得21個(gè)陽性克隆。謝謝你們的幫助！” -Madhusudan Rajendran, UNIV. OF WISCONSIN-MADISON |
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| 圖2. 菌落篩選。菌落PCR用于確定陽性克隆。（圖A）在研究1中，檢測的10個(gè)菌落中有8個(gè)顯示~1.3 kb的條帶，為陽性克隆。（圖B）在研究2中，檢測的32個(gè)菌落中的21個(gè)顯示~2.6 kb的條帶，為陽性克隆。 |
| 【結(jié)論】 |
| 先前基于連接酶方法的克隆工作未能產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果，但使用In-Fusion HD Cloning Plus后，兩個(gè)獨(dú)立的項(xiàng)目都得到了陽性克隆。在每次嘗試中，兩位研究人員都能夠成功地將其具有挑戰(zhàn)性的插入片段克隆到pET表達(dá)載體中。 |
| 詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法和步驟請見： |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/a-successful-alternative-to-ligation-cloning |
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