| In-Fusion Cloning：簡單的多片段克隆解決一個合成的難題 |
| 【數(shù)據(jù)提供】Christian Joerg Braun Postdoc, MIT |
| 【實驗簡介】 |
| 在該研究中，使用In-Fusion克隆將轉(zhuǎn)錄激活結構域的多個重疊片段快速克隆到Cas9-dead病毒表達載體中。插入該結構域的目的是改善轉(zhuǎn)錄基因激活的量。由于激活結構域的二級結構，無法直接合成整個序列，并且，如果使用傳統(tǒng)的基于連接酶的方法以多個片段構建該結構域又沒有合適的限制酶位點。相反，應用In-Fusion技術可以把該結構域的兩段序列合成后在一個反應中完成克隆，無需擔心限制酶位點的兼容性。將全長序列無縫克隆到表達載體中，通過限制酶消化和Sanger測序鑒定陽性克隆。最終載體構建在三天內(nèi)完成，手動操作時間總計僅兩個多小時。 |
| 【用戶感言】 |
| “In-Fusion克隆的速度、準確性和易用性使我確信再次購買該產(chǎn)品。” -Christian Joerg Braun |
| 【實驗結果】 |
| 通過單酶切將準備好的Cas9表達構建體線性化并凝膠純化。設計兩個合成的插入片段，使片段末端之間以及和載體末端帶有重疊的區(qū)域。將兩個插入片段同時克隆到線性化的表達載體中，并用該反應液轉(zhuǎn)化附帶的感受態(tài)細胞。通過限制酶消化進行菌落篩選，并通過測序進一步確認陽性克隆。在篩選的9個菌落中，6個顯示正確的酶切結果（下圖）和測序結果。 |
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| 圖1. 酶切確認陽性克隆。通過EcoR I酶切進行轉(zhuǎn)化菌落的篩選。結果顯示在檢測的9個菌落中有6個陽性菌落。3個陰性菌落是載體自連。數(shù)據(jù)圖片由Christian Braun提供。 |
| 【用戶感言】 |
| “我沒有嘗試過任何其他克隆方法用于本實驗，而是直接測試了In-Fusion克隆方法。限制酶位點的可用性是這個實驗的一個問題，我很高興In-Fusion克隆不需要依賴限制酶位點。” -Christian Joerg Braun |
| 【結論】 |
| 利用In-Fusion技術，僅通過一個克隆反應就將兩個合成的轉(zhuǎn)錄激活結構域序列克隆到Cas9表達載體中，成功率為～67％。激活結構域二級結構的存在導致無法進行全長序列合成，而將序列分成兩部分又沒有合適的酶切位點，無法使用傳統(tǒng)連接酶方法進行克隆。In-Fusion Cloning能夠在三天內(nèi)生成最終的陽性克隆，無需被限制酶位點或后續(xù)的一系列克隆反應所困擾。 |
| 詳細實驗方法和步驟請見： |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/solve-a-synthesis-challenge-with-easy-multiple-insert-cloning |
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