利用In-Fusion Cloning插入小的融合蛋白質(zhì)標(biāo)簽 |
【數(shù)據(jù)提供】Fabio Antenucci Post-doctoral research fellow, Veterinary Clinical Microbiology, University of Copenhagen |
【產(chǎn)品亮點(diǎn)】 |
· 克服了限制酶位點(diǎn)的限制 · 無需標(biāo)簽?zāi)0逡部商砑有〉牡鞍踪|(zhì)標(biāo)記(<10 aa) · 一步反應(yīng)將多個片段和標(biāo)簽插入到載體中 |
【實驗簡介】 |
融合蛋白質(zhì)標(biāo)簽是小的肽鏈,可以用于檢測、純化、確認(rèn)目的蛋白質(zhì)。為了生成標(biāo)簽蛋白質(zhì),需要通過基因工程將標(biāo)簽蛋白質(zhì)的序列插入到目的蛋白質(zhì)序列前,這樣通過表達(dá)重組蛋白質(zhì)來獲得順式標(biāo)簽。 標(biāo)簽重組蛋白質(zhì)的設(shè)計通常需要依賴限制酶的傳統(tǒng)克隆方法。這個方法需要一個供體模板來擴(kuò)增所選擇的標(biāo)簽序列和多個克隆實驗步驟。而不依賴限制酶的克隆方法的出現(xiàn)大大地簡化了這個流程,讓小標(biāo)簽重組蛋白質(zhì)的基因操作在一步反應(yīng)中就可以完成,且標(biāo)簽序列不需要模板。 本實驗例中,使用了In-Fusion HD Cloning Plus構(gòu)建了包含來自兩個不同模板蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的重組嵌合體,并從頭插入了融合標(biāo)簽A-4 (Zhou et al. 2008; Figure 1)。 |
圖1. 實驗例中重組載體構(gòu)建的原理圖。紅色字母表示引物A和引物B的5’端互補(bǔ)區(qū)域。A-4標(biāo)簽的全序列在粉色框中突出顯示。 |
【用戶感言】 |
“In-Fusion真正地幫助我按時間期限完成研究,按照說明書的要求設(shè)計引物并使用推薦的條件,我獲得了接近100%的成功率。 —Fabio Antenucci, University of Copenhagen |
【結(jié)果】 |
目標(biāo)序列的高效率插入且未檢測到脫靶效應(yīng) 為了構(gòu)建圖1中的重組載體(圖1),設(shè)計了三對PCR引物,用于生成帶有重疊部分的擴(kuò)增子并后續(xù)測序(圖2)。挑取了3個包含插入片段的克隆,并檢測圖2標(biāo)出的目標(biāo)序列的整合、突變、基因重排的情況。測序結(jié)果證明了三個克隆均整合了目標(biāo)重組開放閱讀框A-A4-B,并沒有突變和基因重排的情況。 |
圖2. 用于確認(rèn)重組載體上正確開放閱讀框的測序策略。設(shè)計了三對引物,用于生成測序用的三個重疊擴(kuò)增子,進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)構(gòu)域A和B處于A-4標(biāo)簽的兩端的正確順序。 |
【結(jié)論】 |
構(gòu)建標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)是比較耗費(fèi)時間的工作,需要按順序進(jìn)行多個亞克隆步驟來向每個載體插入目標(biāo)片段。而用In-Fusion Cloning獲得了100%的相對效率(3/3陽性克?。?,證明了In-Fusion Cloning方法確實是一步法克隆插入小融合標(biāo)簽的快速有效的方法。 |
詳細(xì)實驗方法和步驟請見: |
https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/de-novo-insertion-of-small-fusion-protein-tags |