| PrimeDirect® Probe RT-qPCR Mix, with UNG實驗例 | ||||||||||||||||||||
| 本制品無需進行RNA純化，可直接以培養(yǎng)細胞或活體材料起始進行Real Time PCR。以下主要介紹使用培養(yǎng)細胞及病毒、細菌、血液、尿液等樣品起始的實驗例。 | ||||||||||||||||||||
| 1. K562細胞 | ||||||||||||||||||||
| 材料： 使用PBS將K562細胞懸液分別按照1×103～105 cells/μl比例稀釋后，各使用1 μl 引物／探針檢出范圍： WT1基因（Cy5標記）／GAPDH基因（FAM標記） |
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| Real Time PCR反應液的制備 | ||||||||||||||||||||
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| * 其他公司的試劑按照各公司推薦的protocol制備反應液。 | ||||||||||||||||||||
| Real Time RT-PCR反應 | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 60℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec |  |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 60℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| * 其他公司試劑的反轉(zhuǎn)錄反應時間，按照各公司推薦的30 min和PrimeDirect Mix相同的5 min分別進行了兩個反應。其他按照各公司protocol推薦的條件進行。 | ||||||||||||||||||||
| 結(jié)論： | ||||||||||||||||||||
| 使用1×103～105 個K562細胞，進行WT1基因（白血病標志）及GAPDH基因（管家基因）的表達分析。反轉(zhuǎn)錄反應5 min的條件下，PrimeDirect Mix具有比其他公司試劑更高的靈敏度檢出上述基因。另外，相比于其他試劑推薦的30 min的反轉(zhuǎn)錄反應時間，PrimeDirect Mix顯示具有與其他公司同等或高于其他公司試劑的靈敏度。 | ||||||||||||||||||||
| WT1基因 | ||||||||||||||||||||
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| GAPDH基因 | ||||||||||||||||||||
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| Takara Bio Inc.比較結(jié)果 | ||||||||||||||||||||
| 2. 金黃葡萄球菌 | ||||||||||||||||||||
| 材料： 金黃葡萄球菌懸液經(jīng)PBS分別稀釋為1×101～103 cfu/μl，各使用1μl 引物／探針檢出范圍： 16S rRNA基因（Cy5標記） |
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| Real Time PCR反應液的制備 | ||||||||||||||||||||
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| * 其他公司的試劑按照各公司推薦的protocol制備反應液。 | ||||||||||||||||||||
| Real Time RT-PCR反應 | ||||||||||||||||||||
| 反應條件1（No RT） | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 60℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| 反應條件2（RT 5min） | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 60℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 60℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| * 其他試劑按照各公司Protocol推薦的反應條件進行反應。 | ||||||||||||||||||||
| 結(jié)論： | ||||||||||||||||||||
| PrimeDirect Mix能夠穩(wěn)定檢出10 cfu金黃葡萄球菌。此外，與以基因組DNA起始按照反應條件1 (No RT) 反應相比，以RNA起始按照反應條件2（RT 5min）進行反轉(zhuǎn)錄反應的實驗顯示出更高的檢出靈敏度。與其他試劑相比，PrimeDirect Mix在反轉(zhuǎn)錄反應為5 min的條件下，顯示比其他反轉(zhuǎn)錄反應30 min的檢出靈敏度高。 | ||||||||||||||||||||
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| Takara Bio Inc.比較結(jié)果 | ||||||||||||||||||||
| 3. 全血中的金黃葡萄球菌 | ||||||||||||||||||||
| 材料： 全血（肝素血及EDTA血）及其10倍稀釋液（PBS）中加入1×101～105 cfu/μl濃度的金黃葡萄球菌，制備好后各使用1μl 引物／探針檢出范圍： 16S rRNA基因（Cy5標記） |
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| Real Time PCR反應液的制備 | ||||||||||||||||||||
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| * 其他公司的試劑按照各公司推薦的protocol制備反應液。 | ||||||||||||||||||||
| Real Time RT-PCR反應 | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 60℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 60℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| 結(jié)論： | ||||||||||||||||||||
| 雖然使用血液成分進行檢出時有阻害，但是PrimeDirect Mix在全血原液中（肝素血、EDTA血）可直接檢出100 cfu，其10倍稀釋液也可以直接檢出10 cfu的金黃葡萄球菌。該實驗顯示，1 μl全血中如果存在100 cfu的金黃葡萄球菌，可以檢出。 | ||||||||||||||||||||
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| 4. a. 尿液中的Zika病毒 | ||||||||||||||||||||
| 材料： 在尿液及其10倍稀釋液（生理鹽水）中，加入2×103 copies/μl濃度的NATtrol Zika Virus（ZeptoMetrix公司）制備起始樣品，然后各使用1 μl 引物／探針檢出范圍： Polyprotein基因（ROX標記） |
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| Real Time PCR反應液的制備 | ||||||||||||||||||||
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| Real Time RT-PCR反應 | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 56℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 56℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| 結(jié)論： | ||||||||||||||||||||
| PrimeDirect Mix不易受尿原液的阻害，可直接檢出尿液中的Zika病毒。 | ||||||||||||||||||||
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| b. 尿液中的Zika病毒（檢出靈敏度） | ||||||||||||||||||||
| 材料： 尿原液中分別添加濃度為2×10-2～103 copies/μl NATtrol Zika Virus制備起始樣品，各使用1 μl 引物／探針檢出范圍： Polyprotein基因（ROX標記） |
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| Real Time PCR反應液的制備 | ||||||||||||||||||||
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| Real Time RT-PCR反應 | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 56℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 56℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| 結(jié)論： | ||||||||||||||||||||
| PrimeDirect Mix不易受尿液阻害，尿液中的Zika病毒2個拷貝以上即可檢出。感染者的尿液中該病毒RNA濃度為2.1 x 10 copies/μl的案例也有報道，使用本試劑能夠滿足檢出靈敏度。 Zika 病毒感染者尿液中病毒RNA濃度的案例：2.1 x 10 copies/μl (https://www.niid.go.jp/niid/ja/id/2358-disease-based/sa/zika-fever/7169-zikara-11-170331.html) |
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| 5. a. 全血中的Zika病毒 | ||||||||||||||||||||
| 材料： 全血（EDTA血）及其10倍稀釋液（生理鹽水），以2×103 copies/μl 的濃度添加NATtrol Zika Virus 制備起始樣品，各使用1 μl 引物／探針檢出范圍： 引物/探針檢出范圍：Polyprotein基因（ROX標記） |
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| Real Time PCR反應液的制備 | ||||||||||||||||||||
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| Real Time RT-PCR反應 | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 56℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 56℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| 結(jié)論： | ||||||||||||||||||||
| 全血原液（EDTA血）有檢出阻害，直接檢出Zika病毒很困難，但是用10倍稀釋液可以檢出。 | ||||||||||||||||||||
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| b. 全血中的Zika病毒（檢出靈敏度） | ||||||||||||||||||||
| 材料： 全血（EDTA血）10倍稀釋液（生理鹽水），以2×10-2～103copies/μl 的濃度加入NATtrol Zika Virus制備起始樣品，各使用1 μl 引物／探針檢出范圍： 引物/探針檢出范圍：Polyprotein基因（ROX標記） |
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| Real Time PCR反應液的制備 | ||||||||||||||||||||
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| Real Time RT-PCR反應 | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 56℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 56℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| 結(jié)論： | ||||||||||||||||||||
| 血液成分對檢出雖然有阻害作用，但全血10倍稀釋液中的Zika病毒2拷貝以上可以檢出。顯示出在全血原液1 μl中存在20拷貝左右的Zika病毒時，可以檢出。 | ||||||||||||||||||||
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| 制品信息 | ||||||||||||||||||||
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