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Recombinant Cas9 Protein GMP grade
哺乳動物細(xì)胞基因組編輯
 
※參考資料：Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl) User Manual
 
[實(shí)驗(yàn)條件]
· 靶細(xì)胞/基因：293T細(xì)胞/CD81
· RNP導(dǎo)入方法：電穿孔（使用儀器：Neon Transfer System [Thermo Fisher Scientific]）
· RNP制備條件：
使用單向?qū)NA (sgRNA) 0.45 μg、本制品0.75 μg/0.25 μl、Resuspension Buffer R（或者T）混合配制7.5 μl溶液、37℃孵育5分鐘后， 4℃靜置。
RNP導(dǎo)入條件：
收集細(xì)胞，PBS洗滌后，使用Buffer R將細(xì)胞重懸至2×107cells/ml。將7.5 μl細(xì)胞懸濁液和7.5 μl RNP溶液相混合，根據(jù)儀器操作手冊將RNPs導(dǎo)入至靶細(xì)胞中。使用以下3種條件進(jìn)行電穿孔實(shí)驗(yàn)（N=3）（表1）。
 
條件 脈沖電壓（V） 脈沖寬度（ms） 脈沖數(shù)
A 1,300 20.0 2
B 1,200 20.0 2
C 1,100 20.0 2
 
基因編輯效率評價(jià)方法：
在上述條件下進(jìn)行電穿孔導(dǎo)入后，將細(xì)胞培養(yǎng)7天，然后與PE標(biāo)記的抗CD81抗體反應(yīng)，通過FCM檢測CD81陰性細(xì)胞率（%）。
 
[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
圖．基因編輯功能評價(jià)
比較A-C導(dǎo)入條件下的基因敲除效率，A條件下脈沖電壓設(shè)定在1,300 V，所獲得的靶標(biāo)基因CD81敲除效率最高（85.4％）。