| 使用Capturem技術(shù)實現(xiàn)快速標記抗體 |
| 簡介 |
| 標記抗體（Abs）是研究人員擴大其應(yīng)用范圍的一個關(guān)鍵途徑。將抗體添加上熒光素或生物素可用于多種基于免疫化學的技術(shù)，同時抗體-藥物偶聯(lián)物又是藥物研究中快速增長的領(lǐng)域。然而，傳統(tǒng)的標記方法需要純化的起始材料和較長的孵育時間。為了改進這一過程，我們采用了Capturem純化技術(shù)來實現(xiàn)快速的柱上標記，可以直接使用未純化的起始材料，在15分鐘內(nèi)即可生成標記抗體。 在下面的實驗例中，我們對靶向Cas9的小鼠IgG進行了熒光素和生物素標記。被標記的抗體可以識別其抗原，表明抗原表位不受標記過程的負面影響。 |
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| 圖1. 直接從任何起始溶液快速標記抗體的工作流程圖。首先，使用Binding buffer稀釋抗體并進行柱平衡。然后，將稀釋的抗體上樣，接著用等體積的wash buffer洗滌。再將標記試劑用適當?shù)腷uffer溶解后加入到柱子中，通過離心操作完成抗體標記過程。為了回收標記的抗體，需要再進行一次洗滌，然后用適當?shù)南疵揵uffer獲得抗體。全部標記過程可在15 min內(nèi)完成。 |
| 熒光素標記 |
| 本實驗例是使用NHS-熒光素進行快速抗體標記。起始材料是含有靶向Cas9的小鼠IgG的雜交瘤培養(yǎng)基，取150 μg抗體上柱，按照產(chǎn)品說明書進行操作，待NHS-熒光素穿透流出后，洗滌，然后進行兩步洗脫，最后得到40 μg熒光素標記的抗體。 我們使用A280和A493的值來測定熒光素和抗體的摩爾比。通過改變NHS-熒光素的加入量（12 eq., 20 eq., 50 eq., 或100 eq.，這里eq.代表摩爾當量），我們可以將熒光素和抗體的分子量比值在2.97-3.3之間改變。雖然增加反應(yīng)中NHS-熒光素的量略微提高了標記抗體的比例，但在12和20 eq.時效果最好。更高水平的熒光素（50和100 eq.）會導(dǎo)致洗脫樣品中有過量的游離染料（圖2）。 |
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| 圖2. 在標記反應(yīng)中增加熒光素的濃度會造成更高的熒光素和抗體比例。左邊的凝膠圖顯示每個孔中熒光素的信號，說明在標記反應(yīng)中隨著染料分子與抗體比例的增高，熒光素信號在增強。每個孔具有相同質(zhì)量的抗體，如右邊的考馬斯染色凝膠中所見。 nc：負對照。泳道1：12 eq.的反應(yīng)。泳道2：20 eq.的反應(yīng)。泳道3：50 eq.的反應(yīng)。泳道4：100 eq.的反應(yīng)。 |
| 抗體的生物素標記 |
| 另一種常見的標記反應(yīng)涉及將生物素連接到抗體上以用于多種檢測，包括使用熒光素進行一級-二級標記用于流式細胞分選（FACS）和成像，或用于ELISA實驗。在本實驗例中，我們使用與熒光素標記實驗類似的操作流程，但使用NHS-生物素作為靶向Cas9的小鼠IgG的標記試劑（圖3）。 |
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| 圖3. 對柱上洗脫的抗體進行Western blot檢測（左）和使用洗脫得到的生物素標記抗體對重組Cas9（rCas9）進行Western blot檢測（右）。左圖結(jié)果表明>90%的生物素標記抗體在前兩次洗脫產(chǎn)物中。在右圖中，每個泳道Cas9上樣量在100-300 ng之間，然后用生物素標記的anti-Cas9抗體來檢測Cas9，結(jié)果顯示，在使用Capturem Protein G Miniprep Columns標記和洗脫之后，結(jié)合表位仍然保持活性。 |
| 標記的操作流程 |
| 所有的標記反應(yīng)均是使用Capturem Protein G Miniprep Columns實現(xiàn)的，EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Cat. No. 21335) 和fluorescein-NHS (Cat. No. 46410) 購自Thermo Fisher Scientific。Biotin-NHS是內(nèi)部合成的，Anti-Cas9抗體為Guide-it Cas9 Monoclonal Antibody (Clone TG8C1) (Cat. No. 632628)。 |
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