| 使用Capturem胰蛋白酶技術(shù)消化蛋白質(zhì)和全細胞裂解物 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Capturem胰蛋白酶 ■ 提供快速和高效的蛋白質(zhì)消化 ■ 能夠消化緊密折疊的蛋白質(zhì) ■ 生成具有高序列覆蓋率的肽 ■ 適用于全細胞裂解液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 |
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| 簡介 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 質(zhì)譜（MS）是用于蛋白質(zhì)組學(xué)和對來自多種生物和細胞類型的蛋白質(zhì)進行表征分析的主要技術(shù)。MS分析中最重要的步驟是樣品制備，需要將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為肽。胰蛋白酶是最常用的蛋白質(zhì)水解酶，可制備用于分析的肽。它是一種高度特異性的絲氨酸蛋白酶，在賴氨酸和精氨酸殘基的羧基側(cè)切割，產(chǎn)生MS分析最佳大小的肽。因此，快速和完全消化對于詳細的蛋白質(zhì)表征分析非常重要。 目前的樣品制備操作是在胰蛋白酶溶液中進行37℃過夜消化。蛋白質(zhì)的長時間消化可能造成氧化或其他蛋白質(zhì)修飾，導(dǎo)致靈敏度差，從而降低了溶液內(nèi)消化的可重復(fù)性，并且也不適合自動化。此外，溶液法胰蛋白酶消化不能完全消化蛋白質(zhì)，從而影響了MS分析中的蛋白質(zhì)鑒定。 Capturem Trypsin可快速、有效、完全地消化蛋白質(zhì)樣品，在室溫下讓MS工作流程更加連貫，以進行下游蛋白質(zhì)分析。該產(chǎn)品的形式是小型離心柱，應(yīng)用我們的新型Capturem膜技術(shù)，膜上固定有胰蛋白酶。Capturem Trypsin柱可用不到一分鐘的時間完全消化蛋白質(zhì)樣品，其消化效率（蛋白質(zhì)覆蓋率）與使用溶液法胰蛋白酶消化的效率相當或更好。快速蛋白質(zhì)消化不僅可以節(jié)省時間，還可以通過減少胰蛋白酶自溶來改善蛋白質(zhì)組學(xué)分析中肽和蛋白質(zhì)的鑒定。 |
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| 實驗結(jié)果 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ 使用Capturem Trypsin進行快速、完全的蛋白質(zhì)消化 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 使用apomyoglobin (Apo) （肽圖譜的常用標準），我們比較了溶液法胰蛋白酶消化與Capturem Trypsin消化法的效率。Apo缺乏二硫鍵，因此在酶消化之前不需要變性和/或還原。胰蛋白酶消化的完全性通常用來衡量消化效率。圖1顯示使用Capturem Trypsin僅需500 g離心1分鐘就可以對Apo樣品進行100％的消化（圖C），而用溶液法胰蛋白酶在16小時后僅消化了70％的Apo樣品，從圖中可以看到明顯的完整Apo的色譜峰（圖B）。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 圖1. 使用Capturem Trypsin實現(xiàn)Apomyoglobin（Apo）的快速完全消化。上圖為使用RP-HPLC分析Capturem Trypsin法和常規(guī)溶液法消化蛋白質(zhì)的結(jié)果，圖A為未消化的完整蛋白質(zhì)，圖B為溶液法室溫消化16 h的蛋白質(zhì)，圖C為使用Capturem Trypsin消化1 min的蛋白質(zhì)。離心柱活化、蛋白質(zhì)消化以及RP-HPLC分析方法參見“實驗方法”部分內(nèi)容。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ 使用Capturem Trypsin消化緊密折疊的蛋白質(zhì) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 溶液法胰蛋白酶消化的另一個限制是如果沒有額外的樣品處理步驟（例如變性和還原），則不能消化高度折疊的蛋白質(zhì)。Myoglobin (Myo) 就是這樣一個例子，它是緊密折疊的球狀蛋白質(zhì)，使用溶液法胰蛋白酶對其消化效果很差。 如圖2所示，Capturem Trypsin柱僅需500 g離心1分鐘就可以將Myo消化成許多蛋白水解肽（圖C）。相反，溶液法胰蛋白酶消化16小時（圖B）未能產(chǎn)生任何蛋白水解肽，并且大多數(shù)Myo仍然未被消化。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 圖2. 使用Capturem Trypsin消化緊密折疊的Myoglobin (Myo)。使用RP-HPLC對Capturem Trypsin法和常規(guī)溶液法消化的產(chǎn)物進行分析，圖A為未消化的完整蛋白質(zhì)，圖B為溶液法室溫消化16 h的蛋白質(zhì)，圖C為使用Capturem Trypsin消化1 min的蛋白質(zhì)。離心柱活化、蛋白質(zhì)消化以及RP-HPLC分析方法參見“實驗方法”部分內(nèi)容。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ 對Capturem Trypsin消化的蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜分析 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 除了確定消化的完全性之外，測量所得肽的序列覆蓋百分比為評估胰蛋白酶消化效率提供了另一種方法。為了確定Capturem Trypsin如何有效地產(chǎn)生具有良好序列覆蓋的肽，我們對用Capturem Trypsin消化的Apo進行了質(zhì)譜分析（MS）分析。 圖3顯示了使用Capturem Trypsin消化的Apo的解卷積ESI-Orbitrap質(zhì)譜。僅在500 g下離心1分鐘即可完全消化Apo。MS分析鑒定出26種Apo的肽，其中7種肽覆蓋100％的氨基酸序列。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 圖3. 對Capturem Trypsin消化肌球蛋白（Apo）產(chǎn)生的肽進行質(zhì)譜分析。對Capturem Trypsin離心柱上消化的Apo，使用Xtract軟件生成解卷積ESI-Orbitrap質(zhì)譜。實驗數(shù)據(jù)由University of Notre Dame的Dr. Merlin Bruening提供。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ Capturem Trypsin消化全細胞裂解物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 我們使用Capturem Trypsin對由BT474導(dǎo)管乳腺癌細胞制成的全細胞裂解物進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以鑒定出盡可能多的特別蛋白質(zhì)。變性的全細胞裂解物通過RP-HPLC（圖4，圖A）分成19份，對每份用Capturem Trypsin消化。 表1中提供了使用Capturem Trypsin消化的每份蛋白質(zhì)的含量。針對每份消化的蛋白質(zhì)分別進行LC / MS-MS分析。圖4，圖B顯示了每份鑒定得到的特別的蛋白質(zhì)的數(shù)量?？傊?，使用Capturem Trypsin對BT474細胞消化然后進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定出2,320種特別蛋白質(zhì)。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 圖4. 使用Capturem Trypsin消化BT474全細胞裂解物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過RP-HPLC將裂解液分成19個獨立的組分（圖A），然后再使用Capturem Trypsin對每個組分分別進行消化，并使用如下的“實驗方法”進行LC/MS-MS分析，鑒定并繪制出每個組分中帶有至少2個特異性肽段的蛋白質(zhì)總數(shù)，如B圖所示。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 結(jié)論 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 與溶液法胰蛋白酶消化相比，Capturem Trypsin 提供更快和更完全的消化，防止因蛋白質(zhì)消化時間過長和/或不完全而影響靈敏度和重現(xiàn)性。當同時使用兩種方法消化apomyoglobin（一種用作蛋白質(zhì)作圖的標準模型蛋白質(zhì)）時，結(jié)果顯示，使用Capturem Trypsin 消化速度更快、更完全。而使用Capturem Trypsin 在消化myoglobin（一種緊密折疊的蛋白質(zhì)）時，也同樣顯示了非常高的效率。使用質(zhì)譜法對Capturem Trypsin消化的apomyoglobin產(chǎn)物進一步分析，證實其消化產(chǎn)生的肽具有良好的序列覆蓋度。使用Capturem Trypsin消化復(fù)雜樣品（一種通過RP-HPLC分離的全細胞裂解物），再用LC / MS-MS分析可鑒定出2,320種特別蛋白質(zhì)。這些性能都證明了Capturem Trypsin是用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的強大工具。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 實驗方法 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ 使用Capturem Trypsin消化Apo和Myo | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 在消化之前，將Apo (80 μg) 或Myo (10 μg) 溶解在200 μl的10 mM碳酸氫銨中。取200 μl試劑盒提供的活化buffer加到Capturem Trypsin離心柱上，500 g離心1分鐘以激活柱子。然后將Apo或Myo溶液加到已活化的柱上，500 g離心1分鐘。洗脫得到的肽進行下游的RP-HPLC和MS分析。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ 使用溶液法胰蛋白酶消化Apo和Myo | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 將Apo (80 μg) 或Myo (10 μg) 溶解在200 μl的10 mM碳酸氫銨中，用于溶液法胰蛋白酶消化。以胰蛋白酶：底物為1:20（w / w）的比率消化4 μg的Apo或0.5 μg的Myo。然后將反應(yīng)混合物在室溫下孵育約16小時。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ 對消化的Apo和Myo進行RP-HPLC分析 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 使用Rainin Dynamax HPLC系統(tǒng)進行RP-HPLC分析。用Aeris 3.6 μm PEPTIDE XB-C18色譜柱（100?，50 x 4.6 mm）（Phenomenex）經(jīng)兩種溶液梯度洗脫（溶液 A：95%水 + 5%乙腈 + 0.1% TFA [v/v]；溶液B：10％水+ 90％乙腈+ 0.085％TFA [v / v]）并于215 nm下進行分析。應(yīng)用以下梯度程序：95％溶液A持續(xù)2分鐘，5-60％溶液B持續(xù)24分鐘，60-70％溶液B持續(xù)1分鐘，70％溶液B持續(xù)2分鐘。加樣前用95％溶液A進行5分鐘的平衡。加樣體積為20 μl。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ 質(zhì)譜分析Capturem Trypsin消化的Apo | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 對于直接注入式MS，洗脫的肽需要經(jīng)SpeedVac干燥并在1％乙酸、49％H2O和50％甲醇的溶液中重構(gòu)樣品。然后將40 μl重構(gòu)的樣品加載到Whatman Multi-Chem 96孔微孔板（Sigma-Aldrich）中，并用Teflon Ultrathin Sealing Tape（Analytical Sales and Services）密封。使用Advion Triversa Nanomate納米電噴霧電離（nESI）源（Advion）將樣品引入配備有雙壓力離子阱、HCD池和ETD的高分辨率、高質(zhì)量精度LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific）。噴霧電壓和氣體壓力分別設(shè)定為1.4kV和1.0psi。離子源界面的入口溫度為200℃，S-Lens值為57％。使用FT分析儀以100,000的質(zhì)量分辨率操作，在300-1,800的m / z范圍內(nèi)以正電離模式獲得高分辨率質(zhì)譜。光譜是100次掃描的平均值。分析具有> 1％的最高峰強度和S / N> 3的信號。使用ProteinProspector（v 5.14.1，University of California，San Francisco）對肽進行手動鑒定，分析包括最多5個酶漏切位點，質(zhì)量耐受性設(shè)定為10 ppm，不匹配設(shè)置為2。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ BT474全細胞裂解物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 在洛杉磯南加州大學(xué)的Kian Kani教授的實驗室中使用由BT474乳腺導(dǎo)管癌細胞制成的全細胞裂解物進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。簡言之，將BT474細胞在PBS，1％OG中裂解，其中添加有蛋白酶和磷酸酶抑制劑。然后將細胞裂解物在鹽酸胍終濃度為6 M的PBS/OG進行還原（5 mM DTT）和烷基化（50 mM IAA）。使用液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜（LC / MS-MS）以數(shù)據(jù)依賴模式進行蛋白質(zhì)鑒定。為了降低樣品復(fù)雜性，需要進行初始的RP-HPLC蛋白質(zhì)分級分離，方法是注射2 mg蛋白質(zhì)裂解物（在含3 M鹽酸胍的PBS中）然后每30秒收集1 ml組分，總共19個單獨的組分，然后冷凍，用SpeedVac干燥。將每個組分重懸于含有1 M尿素+ 1％乙腈（ACN）的100 mM碳酸氫銨緩沖液（pH8.0）中，總體積為200 μl。使用Capturem Trypsin按照Protocol-At-A-Glance中所述方法分別消化每個組分，并向每個柱洗脫液中加入2 μl乙酸以終止消化反應(yīng)，然后用C18ZipTip過濾器清洗，冷凍，并用SpeedVac干燥。 然后將每個組分重懸于25 μl的H2O / ACN / FA（體積比為95/5/0.1）溶液（至大約2 μg/μl的濃度）中。 每個重懸組分取10 μl注入LTQ-FTICR或LTQ-ORBITRAP質(zhì)譜儀（Thermo-Finnigan）進行LC-MS / MS檢測，所述質(zhì)譜儀與帶有25 cm柱（Picofrit 75 μm ID, New Objectives）的納流液色譜系統(tǒng)（Eksigent）偶聯(lián)，柱子內(nèi)部裝有MagicC18樹脂（Michrom Bioresources），線性梯度為90分鐘。以隨機順序?qū)?9個樣品進行MS。獲取的數(shù)據(jù)由 Computational Proteomics Analysis System自動處理。針對人類國際蛋白質(zhì)索引數(shù)據(jù)庫（60,428個蛋白質(zhì)條目）的3.13版本搜索串聯(lián)質(zhì)譜，添加5個人和牛胰蛋白酶序列。搜索是用X！Tandem（2005.12.01）進行的。在搜索期間將前體離子的質(zhì)量耐受性設(shè)定為1AMU，碎片離子的質(zhì)量公差設(shè)定為0.5道爾頓。但是，低于百萬分之五質(zhì)量準確度的匹配被認為是假陽性并忽略。將PeptideProphet概率大于0.9的所有鑒定物提交至ProteinProphet，隨后的蛋白質(zhì)鑒定以1％錯誤率用胰蛋白酶片段（2個漏切位點）過濾，允許固定修飾C = 57.021，可變修飾C = -17.027, E = -18.011, K = 6.020, M = 15.995, Q = -17.027。通過每種蛋白質(zhì)中存在2種或更多種肽來鑒定蛋白質(zhì)。 |
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