| In-Fusion Cloning：更快速地得到比TOPO克隆更準(zhǔn)確的結(jié)果 |
| 【數(shù)據(jù)提供】Juanita Von Dwingelo Ph.D. Candidate, University of Louisville |
| 【實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介】 |
| Juanita Von Dwingelo和她的同事一直在通過(guò)酵母雙雜交研究目的蛋白質(zhì)和宿主蛋白質(zhì)之間的相互作用。TOPO克隆方法已成為克隆這些目的蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)工作流程的一部分，然而，TOPO克隆方法卻導(dǎo)致了克隆實(shí)驗(yàn)花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)并且結(jié)果通常不可靠。當(dāng)他們嘗試使用In-Fusion Cloning構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)獲得陽(yáng)性克隆結(jié)果所花費(fèi)的時(shí)間減少了兩天，并得到了100％的克隆效率。 |
| 【用戶感言】 |
| “我們的實(shí)驗(yàn)室主要使用一種耗時(shí)很長(zhǎng)且結(jié)果不可預(yù)測(cè)的方法將目的蛋白質(zhì)克隆到不同的載體中。以前我們使用過(guò)TOPO方法。。。 這是一個(gè)相對(duì)冗長(zhǎng)的過(guò)程，從開(kāi)始到結(jié)束平均需要五天。我們的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了相當(dāng)多的克隆，因此找到一種更快捷的克隆方法會(huì)很有用。” -Juanita Von Dwingelo |
| 【結(jié)果】 |
| 使用BamH I和Sal I雙酶切將酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7線性化，從嗜肺軍團(tuán)菌中PCR擴(kuò)增真核樣錨蛋白質(zhì)效應(yīng)子AnkH，使用引物在PCR產(chǎn)物末尾加入線性化載體末端序列。凝膠純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，定量后與線性化載體進(jìn)行In-Fusion克隆反應(yīng)，反應(yīng)液轉(zhuǎn)化試劑盒中包含的感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆。克隆方案的總時(shí)間為3天，檢測(cè)的10個(gè)菌落中有10個(gè)含有正確的插入片段。 |
| 【用戶感言】 |
| “我肯定會(huì)再次使用[In-Fusion Cloning]，因?yàn)榕c其他克隆方法相比，這是一個(gè)非常簡(jiǎn)單快速的過(guò)程，而其他方法需要更多的時(shí)間，而且不那么可靠。” -Juanita Von Dwingelo |
| 【結(jié)論】 |
| In-Fusion技術(shù)改進(jìn)了酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中目的蛋白質(zhì)克隆的工作流程，提高了克隆速度和準(zhǔn)確性。觀察到的克隆效率為100％，而之前使用的TOPO克隆方法效率僅為50-75％。此外，使用In-Fusion系統(tǒng)進(jìn)行克隆所花費(fèi)的時(shí)間更少，之前方法需五天時(shí)間，而In-Fusion三天內(nèi)就完成了目的載體的構(gòu)建。 |
| 詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法和步驟請(qǐng)見(jiàn)： |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/outperforming-topo-cloning |
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